Universidad central del ecuador facultad de ciencias quimicas laboratorio de biotecnologíA




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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA



CAHUASQUÍ LUNA JIMENA

18/ABRIL/2011

CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA


Métodos turbidimétricos (ópticos).

Consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes.


  1. Espectrofotómetro:


Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema.

La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (λ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.

Para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariorecuento_archivos/image006.gif
Absorbancia en función del Peso Seco
Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer.

El inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariorecuento_archivos/image007.gif
Absorbancia en función del Peso Seco


http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariorecuento_archivos/image008.gif
Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales
En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

(1)

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la Ley de Beer.

El inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de absorción

  1. Nefelómetro:

Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Este método consiste en varios tubos de vidrio con BaCl2 al 1% + cantidades crecientes de H2SO4 al 1%; donde se origina un precipitado de BaSO4, origen de la turbidez, la cual se relaciona con un número de células/ mL. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro se usa generalmente el tubo 6 de

(ESCALA MC FARLAND; SULFATO DE BARIO. TUBOS 1 A 10) (2)

Tubo

Millones de bacterias/ mL

Escala de MacFarland

1

300

4.0

2

600

3.7

3

900

3.5

4

1.200

3.4

5

1.500

3.3

6

1.800

3.2

7

2.100

3.15

8

2.400

3.10

9

2.700

3.04

10

3.000

3.00




  • Ventajas

Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos

  • Desventajas

Pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular). (3)

Bibliografía


1. MEDIDAS DE CRECIMIENTO. [En línea] http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioRecuento.htm.

2. ESCALA MACFARLAND. [En línea] http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales%20teoricos/crecimiento.pdf.

3. RECUENTO DE MICROORGANISMOS. [En línea] http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiologia_de_los_al.htm.

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