Informe 1: practica esterilizacióN + practica morfologia microbiana y muestreo de ambientes y superficies + practica micromycetos






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títuloInforme 1: practica esterilizacióN + practica morfologia microbiana y muestreo de ambientes y superficies + practica micromycetos
fecha de publicación07.01.2016
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Fardy Díaz Microbiología Ambiental Laura Vélez FUAC

INFORME 1: PRACTICA 1. ESTERILIZACIÓN + PRACTICA 2. MORFOLOGIA MICROBIANA Y MUESTREO DE AMBIENTES Y SUPERFICIES + PRACTICA 7. MICROMYCETOS

RESUMEN

En el laboratorio de microbiología se realizaron los pasos y se conocieron los requisitos mínimos para poder esterilizar y operar adecuadamente los implementos de trabajo, en la práctica 1 se conocieron los métodos de eliminación total de las bacterias que contaminan las herramientas de laboratorio durante su uso como lo son cajas de petri; asas; probetas etc. También se realizo la preparación de dos tipos de agar en nuestro caso correspondió el agar Plate Count, utilizado para cultivar bacterias y el agar saboreaud para cultivar hongos. Una semana después en el laboratorio de microbiología se tomaron muestras de yogur, de la boca de un compañero, también se hizo muestreo de superficies en la sede de ingeniería ambiental, en manos de un compañero y otra al ambiente, por último se sembraron en los agares saboreau y plate count para cultivar las muestras anteriormente mencionadas. Ahora bien una semana después se revisaron las muestras y se hizo el reconocimiento morfológico de las bacterias cultivadas de yogur, boca, ambiente, superficie y manos a través de la tinción de gram y observando en el microscopio. Finalmente para la práctica siete se analizaron los hongos cultivados en la practica 2 y se hizo su respectiva identificación.

Palabras Clave: Esterilización, hongos, bacterias agar

ABSTRACT

In the microbiology laboratory were performed the steps and met the minimum requirements to operate properly sterilized and work tools, in practice the methods met a total elimination of bacteria that contaminate the laboratory tools for use as are petri dishes, handles, cylinders etc. Also we made the preparation of two types of agar in our case accounted Plate Count agar, used to grow bacteria and fungi to grow Saboreaud agar. A week later at the microbiology laboratory yogurt samples were taken from the mouth of a partner, was also sampled surfaces at the headquarters environmental engineering in the hands of a partner and the other to atmosphere, and finally planted in the and plate count agars saboreau to grow the samples above. But a week after the samples were revised and became the morphological recognition of bacteria cultured yogurt, mouth, atmosphere, surface and hands through Gram staining and observing under the microscope. Finally, to practice seven cultivated mushrooms were analyzed in practice 2 and their respective identification was made.

Keywords: Sterilization, fungi, bacteria agar

Objetivo General

Realizar prácticas de laboratorio a través de las guías y especificaciones dadas por la profesora de microbiología.

Objetivos Específicos

  1. Esterilizar los materiales de laboratorio.

  2. Cultivar hongos y bacterias a través de los agares dados en la práctica.

  3. Realizar muestreos para aislar microorganismos.

  4. Preparar eficientemente agares para el cultivo de hongos y bacterias.

  5. Identificar las especies de hongos y bacterias encontrados en el laboratorio

  6. Aprender a realizar un montaje microscópico para la observación de hongos unicelulares y pluricelulares.

  7. Aprender a realizar un microcultivo para la observación de estructuras fúngicas intactas.

  8. Reconocer las diferentes estructuras fúngicas vegetativas y de reproducción.

1.1: Materiales Práctica 1.1: Esterilización

  1. Papel Kraft

  2. Horno Eléctrico

  3. Cajas de petri

  4. Pipetas

1: Metodología Práctica 1: Esterilización

Se realizo la limpieza del mesón de trabajo con alcohol, después se tomaron tiras de papel Kraf y se envolvieron las pipetas con mucho cuidado de que quedaran bien empacadas, luego se envolvieron en grupos de 3 cajas de petri en fila una encima de otra y se envolvieron, observamos de que estuvieran bien envueltas, finalmente el material se marco con los nombres de los integrantes y se llevo el hasta el horno eléctrico que elimina todo tipo de vida incluidas las endoesporas a través de calor seco para esto se calibro la temperatura del horno a 160 grados centígrados que es la utilizada en la técnica de esterilización de material de laboratorio y se cronometro un tiempo de dos horas para la eliminación total de microorganismos que se encontrasen en ese momento en las cajas de petri y pipetas ya para finalizar con mucho cuidado se retiro el material con guantes y se dejo enfriar para su posterior uso.

1.2 Materiales Practica 1.2 Esterilización medios de cultivo

  1. Agua Destilada.

  2. Medio de cultivo Standard Plate Count Agar

  3. Medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar / Potato Dextrose Agar (SDA/PDA)

  4. Cajas de Petri.

  5. Frascos tapa rosca.

  6. Cinta indicadora.

  7. Balanza.

  8. Estufa.

  9. Autoclave.

1.2 Metodología Practica 1.2 Esterilización medios de cultivo

Los medios de cultivo para microorganismos se venden en forma deshidratada, de modo que su preparación implica únicamente mezclarlo con agua destilada, pesando la cantidad recomendada por el fabricante.

  1. Se pesó la cantidad requerida del cultivo deshidratado de acuerdo a las instrucciones de la etiqueta.

  2. Se transfirió el polvo a un recipiente de vidrio resistente al calor se agrego el agua destilada medida en una probeta.

  3. Se calentó el medio de cultivo hasta su ebullición.

  4. En el caso del PDA o SDA adicionar el cloranfenicol después de la ebullición, inmediatamente antes de ingresar el medio al autoclave.

  5. Se Colocó tapa rosca sin apretar, o papel aluminio, para esterilizar el medio en autoclave.

  6. Se colocó cinta indicadora sobre la tapa del recipiente.

PROCESO DE ESTERILIZACION

Con el fin de eliminar todos los microorganismos contaminantes y obtener el crecimiento únicamente de los organismos que nos interesan, los medios de cultivo son sometidos a un tratamiento térmico conocido como esterilización húmeda por medio de un equipo conocido como autoclave.

El autoclave es un equipo hermético que permite la entrada de vapor de agua a presión. El uso de calor húmedo permite la muerte de los microorganismos incluidas las endoesporas bacterianas. Experimentalmente se ha determinado que el tiempo requerido para matar las endoesporas bacterianas es de 10-20 minutos y la temperatura de 1210C, razón por la cual los autoclaves se han diseñado para alcanzar esta temperatura. El autoclave utiliza la presión para lograr esta temperatura, siendo la presión de 15 libras por pulgada cuadrada, la requerida para lograr 1210C de temperatura.

1.3 Metodología Practica1.3 Esterilización de cultivos

  1. Se coloco un pequeño trozo de cinta indicadora a cada uno de los elementos a esterilizar, con el fin de confirmar al final del ciclo de esterilización, que la temperatura de 1210C fue alcanzada en cada uno de los materiales esterilizados.

  2. Se introdujeron los elementos en el autoclave dejando suficiente espacio entre ellos, para permitir un adecuado contacto con el vapor.

  3. El tiempo de esterilización de los medios de cultivo vienen definidos por el fabricante en la etiqueta correspondiente, generalmente es de 10-15 minutos.

  4. Una vez cumplido el tiempo de esterilización y únicamente cuando el indicador de presión marque cero, podemos abrir el autoclave, dejando la puerta o tapa entreabierta por 15 minutos.

  5. Utilizando alguna protección para el calor, se retiro el medio de cultivo nos permitió que se enfríe ligeramente, al ambiente (No colocarlo en agua o en una superficie muy fría).

  6. Cuando tenga una temperatura cercana a los 500C, lo vertió en las cajas de Petri, esterilizadas previamente en el horno, en una superficie previamente desinfectada y siempre cerca de la llama.

  7. Se marcaron las cajas con las iníciales del medio de cultivo utilizado, en la tapa.

  8. Una vez el medio se encuentre a una temperatura por debajo de 450C, se solidifica y puede ser utilizado.

  9. Si el medio no se ha de utilizar inmediatamente se guardo en forma invertida en la nevera.

  10. Se tomó una caja de cada tipo de medio y se colocó en la incubadora a 30ºC como prueba de esterilidad del medio de cultivo.

  11. Se observó las cajas a las 24 horas. Si el procedimiento ha sido adecuado no debe aparecer ningún tipo de crecimiento en las cajas incubadas.

2.1 Materiales Practica 2.1 Morfología bacteriana

  1. Crystal Violeta.

  2. Lugol.

  3. Alcohol Acetona.

  4. Fuscina.

  5. Microscopio.

  6. Mechero.

  7. Agar Plate Count.

  8. Cajas de petri.

  9. Gotero.

  10. Yogur

2.1 Metodología

Morfología Bacteriana

En esta práctica se tomaron muestras del sarro dental de un compañero de laboratorio, de yogur natural y contaminación ambiental brindada por el laboratorio. Ahora esas muestras tomadas a través de un asa metálica y un algodón se esparcen en una lamina de vidrio, luego se le aplica una gota de agua y se seca las muestras con el mechero, ya secas la muestras se le realizó el proceso de la tinción de gram que consiste en identificar el tipo bacterias a través de una serie de químicos que se le aplican en el siguiente orden y tiempo de exposición:

Tabla : Tinción de Gram

Compuesto

Tiempo de Exposición

Crystal Violeta

1 Minuto

Se lava la muestra

Se lava la muestra

Lugol

1 Minuto

Se lava la muestra

Se lava la muestra

Alcohol Acetona

15 – 30 Segundos

Se lava la muestra

Se lava la muestra

Fuscina

1 Minuto

Hay dos tipos de bacterias, gram positivas y gram negativas. Las bacterias gram positivas se pueden apreciar en el microscopio de coloración morada, las bacterias gram negativas se pueden mirar en el microscopio de color rosada, ahora bien esto es porque las bacterias se componen de peptidoglucano, en las bacterias gram positivas se determinan que absorben hasta un 90% de peptidoglucano, mientras que las bacterias gram negativas absorben un 10% de peptidoglucano

Después de que se realizó la tinción de gram las tres muestras se marcaron y se dejaron secar para su correspondiente análisis en el laboratorio de microscopia, en donde se determino el tipo de bacteria por su coloración y su forma esto con ayuda de bibliografía para determinar con precisión e identificar el nombre de las bacterias.

2.2 Metodología

Muestreo de Ambientes y Superficies

Se preparó agar para cultivar bacterias y agar para cultivar hongos, se escogió agar plate count para aislar las bacterias y agar saboreaud para cultivar los hongos. El agar Plate count(1) esta hecho de nutrientes de suplemento de tryptone, vitaminas de extractos y glucosa que le dan energía para el crecimiento de las bacterias, su preparación normal es 25g del agar deshidratado en 1 litro de agua destilada, hervir lentamente y agitar hasta que se disuelva, esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121 °C y finalmente servir en las cajas de petri. Ahora el agar Saboreaud(2) se utiliza para cultivar hongos y levaduras, este agar esta hecho a partir de muestras de alimentos, derivados de leche y cosméticos. Algunos procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido tartárico al 10 %, para inhibir el crecimiento bacteriano. Su preparación recomendada es 39g del medio en un litro de agua destilada, calentar y hervir 1 minuto y esterilizar en el autoclave a 121 °C y dejar enfriar durante 15 minutos a una temperatura de 40 – 45 °C y servir en las cajas de petri estériles. Las muestras son tomadas en manos de un compañero, ambiente y superficies, se hizo muestreo de superficie el en borde de la baranda de una escalera, la de ambiente se hizo al aire libre en un pequeño patio y la de manos se pasó el isopo entre los nudillos y las uñas de las manos de un compañero, se tomo un tubo de ensayo con agua destilada y se sumergió la muestra, también se hizo lo del tubo de ensayo con la muestra de superficies. Después de hacer esto se realizó el respectivo cultivo en el agar para bacterias dentro de las cajas de petri y en el agar de los hongos en la respectiva caja de petri . Se determino la temperatura de crecimiento de las bacterias a 37 °C, durante 24 – 48 horas y para los hongos de 8 dias de incubación a una temperatura de 25 – 28 °C. En total se hizo esto en 6 cajas de petri, 3 para hongos y 3 para bacterias. Luego se realizo el proceso de esterilización en una cámara a través de un horno que funcionaba con bombillos halógenos, primero se limpio el mesón con alcohol, después se acomodaron las 6 cajas de petri una encima de otra, finalmente se encendió la cámara y se espero un lapso de tiempo de 10 minutos para retirar las cajas de petri y volver a limpiar el mesón con alcohol, ya para terminar se dejaron las cajas de petri marcadas con la fecha, agar y tipo de muestreo, es decir ambiente, manos y superficie.

  1. Materiales Práctica Micromycetos.

  1. Portaobjetos

  2. Cuabreobjetos.

  3. Asas Micológicas.

  4. Tinción de Azul de Lactofenol

  5. Cultivos fúngicos.

  6. Acido láctico.

  7. Solución estéril de glicerina al 5%.

  8. Caja de petri con cámara húmeda para montaje de microcultivo.

  9. Bisturís.

  10. Alcohol al 70%.

  11. Pipetas estériles.

  12. Microscopio.

  13. Mechero.



    1. Metodología Práctica Micromycetos.


Montaje

Se desinfectó el mesón de trabajo con alcohol en concentración al 70%, Luego se paso el bisturí por el mechero para eliminar contaminación y se hizo un corte cuadrado de 1 cm2 en el agar ya preparado de P.D.A para hongos, el cuadrado de agar cortado se colocó sobre una lámina de la cámara húmeda y se paso por el mechero un cubreobjetos y se puso por encima de la superficie del agar, después se aplicó 2 ml de solución estéril de glicerina al 5%, en el fondo de la cámara húmeda , se tomó la muestra de los hongos cultivados desde la practica 2, se escogió la muestra de ambiente, se abrió la caja de petri del cultivo de hongos de ambiente cerca del mechero para que no se contaminara y se realizó la toma de muestra a través de un asa previamente flameada en el mechero, ya con la pequeña porción de muestra se sembraron 4 puntos en el agar y se le puso el cubreobjetos, para finalizar la muestra se incuba en un tiempo de 5 – 8 días, la caja se invierte y se marca con los nombres de los integrantes del grupo, se somete a temperatura ambiente para su posterior análisis en el microscopio.

Observación de microcultivo

Pasada una semana después de someter una muestra ambiente de hongo a la cámara húmeda se retira el cubreobjetos, ahora bien previamente en el laboratorio de microscopia se aplica una gota de azul de lactofenol a la lamina de vidrio y graduar el aumento del microscopio a 10x y 40x y se registro las estructuras del hongo.

Resultados. Practica: 1 Esterilización

A la semana de la práctica de esterilización gracias a la acción del papel kraf que protegió el material de vidrio utilizado, es decir las cajas de petri y las pipetas del ambiente para que no se contaminaran, estos permanecieron estériles y listos para usarse en el laboratorio. También porque las grandes temperaturas del horno eliminaron toda forma de vida porque cambia bruscamente el ambiente de las bacterias e inhibe que estas puedan generar endoesporas, al no poder hacer esto entran en un fase de muerte por falta de nutrientes para su supervivencia.

Para preparar los agares en el laboratorio de microbiología es muy necesario seguir las indicaciones en la etiqueta de los frascos, ser muy cuidadosos en aspectos tan fundamentales en su preparación como lo son temperatura, presión, cantidad disuelta, volumen a preparar, en caso de no encontrar el agar preparado conseguir la ficha técnica para su preparación y seguir las recomendaciones anteriores. Esto es importante para el optimo desarrollo de las bacterias y hongos a cultivar. Resultados Práctica 7: Micromycetos

Resultados Práctica 7: Micromycetos

Imagen 1: Hongo muestra de manos

Morfología Macroscópica. Medio de cultivo: saboreaud manos

Temperatura de incubación: ambiente

Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8 marzo 2012

Diámetro de la colonia: 4

Color del anverso de la colonia: gris oscuro

Color del reverso de la colonia: negro

Presencia de pigmentos difusibles: no

Presencia de plegamientos o surcos: si

Presencia de zonación: ocupa un gran espacio

Textura: aterciopelada
Imagen 2: Hongo muestra de superficie

Medio de cultivo: saboreaud

Temperatura de incubación: ambiente

Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8 marzo 2012

Diámetro de la colonia: 0.7

Color del anverso de la colonia: rosado

Color del reverso de la colonia: anaranjado

Presencia de pigmentos difusibles: no

Presencia de plegamientos o surcos: no

Presencia de zonación: muy remoto y pequeño el espacio

Textura: cremosa

Imagen 3: Hongo muestra de ambiente

Medio de cultivo: saboreaud

Temperatura de incubación: ambiente

Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8 marzo 2012

Diámetro de la colonia: 5.5

Color del anverso de la colonia: gris claro

Color del reverso de la colonia: negro

Presencia de pigmentos difusibles: no

Presencia de plegamientos o surcos: si

Presencia de zonación: ¼ de la caja de petri

Textura: algodonoso

Morfología Microscópica

Imagen 4: Hongo de muestra de manos

Hongo levaduriforme: no

Hongo micelial o filamentoso: si

Hifas cenocíticas o aseptadas: cenociticas

Hifas septadas: si

Presenta estructuras de reproducción: fragmospora

Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos globosos o piriformes que en el interior contienen conidias: si

Presenta cuerpos fructíferos que en el interior contienen ascos y ascosporas: si

Imagen 5: Hongo muestra de superficie

Hongo levaduriforme: si

Hongo micelial o filamentoso: no

Hifas cenocíticas o aseptadas:

Hifas septadas: no

Presenta estructuras de reproducción: amerosporas

Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos globosos o piriformes que en el interior contienen conidias: si

Presenta cuerpos fructíferos que en el interior contienen ascos y ascosporas: si

Imagen 6: de la muestra de ambiente

Hongo levaduriforme: no

Hongo micelial o filamentoso: si

Hifas cenocíticas o aseptadas: cenociticas

Hifas septadas: no

Presenta estructuras de reproducción: escolespora

Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos globosos o piriformes que en el interior contienen conidias: no

Presenta cuerpos fructíferos que en el interior contienen ascos y ascosporas: si

Discusión de Resultados Práctica de esterilización.

La esterilización es el proceso por el que todas las células vivas, esporas viables virus y viroides son destruidos o eliminados de un objeto o hábitat. Un objeto esterilizado esta totalmente libre de microorganismos viables, esporas y otros agentes infecciosos (Prescott M, 2004),(3)

En el presente trabajo se eliminaron los microorganismos que pudieran estar presentes en los implementos de trabajo los cuales son las cajas de petri y las pipetas a través del autoclave permitiendo la inhibición de endoesporas de las baterías

Tabla 2: Experimento teórico de destrucción térmica microbiana

minutos

Numero inicial MO

MO Destruidos en 1 min. (90% del total)

Mo sobrevivientes

Log De supervivientes

1

106


9 * 105


105

5

2

105


9 * 104


104

4

3

104


9 * 103


103

3

4

103


9 * 102


102

2

5

102


9 * 101


10

1

6


101



9


1


0

7

1


0.9

0.1

-1

Se asume que la muestra inicial contiene 106 microorganismos vegetativos por ml, y el 90% de los microorganismos se destruyen cada minuto de exposición. La temperatura es de 121 C (Prescott M, 2004)(3)

El tiempo que se utilizó para la esterilización del material de laboratorio fue de 15 – 20 minutos a la temperatura de 120 C y con la explicación de la tabla anterior no cabe duda que se eliminó totalmente microorganismos que se encuentre en el material de vidrio de laboratorio. El equipo Usado para esto fue el autoclave.

Discusión de Resultados Práctica de Micromycetos.

En la mayoría de los hongos se presenta formación de de una estructura externa que envuelve las esporas sexuales protegiendolas de las condiciones adversas. Este tipo de estructutras se denominan, según el caso, Zigote, Ascocarpo, dando el nombre a los tres grandes grupos de hongos Zigomycetes, Ascomycetes y Basidiomycetes (Suarez M, Muñoz J,),(4)

De los tres hongos analizados en el laboratorio, se observó en el microscopio por su morfología microscópica que presentan ascosporas con lo cual se deduce que los hongos que se estudiaron pertenecen al grupo de hongos conocido con el nombre de Ascomycetes.

Los Ascomycetes protegen las esporas sexuales dentro de un asco o asca. Los Ascomycetes mas sencillos hacen la reproducción dentro de un asco desnudo, tal es el caso de algunos levaduras como la Candida guillermondii Otros Ascomycetes han adoptado un proceso de protección mas elaborado para sus esporas :los ascos se envuelven dentro de un ovillo de hifas que forman el ascocarpo; este según su forma y la manera como libera las esporas, recibe diferentes nombres nombres como lo son: peritecio, apotecio y clesitotesio. (Suarez M, Muñoz J,), (4)

En la morfología microscópica de las muestras de manos (figura 4) se puede establecer que posee un proceso de protección mas elaborado en sus esporas porque posee hifas septadas, También la muestra de ambiente(figura 6) se observo que el hongo microscópicamente posee hifas no septadas con las miasmas propiedades de la muestra anterior. Por ultimo la (figura 5) corresponde a una levadura ya que se observo que no posee hifas y que su morfología microscópica evidencia que tiene crecimiento radial y textura cremosa características típicas de las levaduras.

Conclusiones

  1. La esterilización elimina con eficacia los microorganismos y sus esporas garantizando buen manejo del material en el laboratorio.

  2. Los agares son el hogar de bacterias y hongos para su óptimo desarrollo en el laboratorio.

  3. Los muestreos dan una información fundamental a la hora de hacer estudios con microorganismos.

  4. Preparar el agar garantiza un óptimo desarrollo de cultivos de bacterias y hongos.

  5. Con libros y el microscopio podemos identificar especies de hongos.

  6. Con la ayuda de químicos como el lactofenol se puede observar hongos a la perfección.

  7. Tener cuidado a la hora de realizar procesos como extracción de muestras.

  8. Teniendo bibliografía disponible se puede identificar macroscópicamente y microscópicamente diversas especies de hongos.

Bibliografía

  1. Medicatec, Biokar Diagnostics – Rue des Quarante Mines, consultado el 11 abril de 2012http://www.medicatec.com/arg/?291,%28bk144ha%29-plate-count-agar-%28p.c.a.%29-500-grs.

  2. Mcdlab, Especificaciones agar dextrosa y papa, México, consultado el 11 de abril de2012http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_dextrosa_papa.pdf.

  3. Prescott M, Microbiología. 5ed. Madrid, McGraw Hill, 147 -149p.

  4. Suárez M, Muñoz J,. Manual de fundamentos de Micología. Universidad Javeriana, Falcultad de ciencias. 1999. 15 19p.

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