Experimento 1: Efectos del estrés salino en plantas






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BIOLOGÍA EXPERIMENTAL I

EXPERIMENTOS DE FISIOLOGÍA DEL ESTRÉS EN VEGETALES

Molinari Novoa, Eduardo Antonio

20090095

QUÉ ES EL ESTRÉS:


El estrés se identifica como una desviación significativa de las condiciones óptimas para la vida. Dichas condiciones ocasionan cambios en todo los niveles funcionales de los organismos. Desde un punto de vista biológico, el estrés tiene una connotación más amplia, refiriéndose a los cambios ambientales que alteran al estado fisiológico de las plantas (Larcher, 1995).

El estrés es el conjunto de respuestas bioquímicas o fisiológicas que definen un estado particular del organismo diferente al observado bajo un rango de condiciones óptimas.

(Basurto Sotelo et al., 2008)
Experimento 1: Efectos del estrés salino en plantas

1. Introducción

Se comparará la respuesta de dos especies de la misma familia botánica al estrés salino: una que realiza ajuste osmótico, Beta vulgaris L. “betarraga” (Betoideae: Amaranthaceae: Caryophyllales); y otra que no, Spinacia oleracea L. “espinaca” (Chenopodioideae: Amaranthaceae: Caryophyllales). Para este fin se someterán los sujetos experimentales a diferentes salinidades durante el tiempo necesario para observar los efectos. Cada tratamiento tendrá tres repeticiones sobre cada especie: se considerará un grupo control y dos grupos experimentales. Al final del experimento, se analizará cuantitativamente el tamaño de la planta, sus pesos fresco y seco, la presencia de clorofilas (A y B) y la concentración de nitrato reductasas en cada individuo. Se escogió dichas especies debido al conocimiento de la ausencia de ajuste osmótico importante y ampliamente efectivo en S. oleracea, constatado en numerosas publicaciones científicas recientes (V. Hoyos, Rodríguez, Cárdenas-Hernández y Balaguera-López; 2009); y a la reputación avalada por estudios científicos sobre la tolerancia de B. vulgaris a la sequía y su aptitud para el ajuste osmótico (Katerji, van Hoorn, Hamdy, Mastrorilli, y Mou Karzel; 1997). La medición de la salinidad se hará a través de la medición de la conductividad eléctrica, expresada en decisiemens por metro.

2. Procedimiento Experimental

Instalación del experimento: Se tomó dieciocho macetas de “tecnopor” (poliestireno expansible, EPS por sus siglas en inglés), las cuales se rellenó con arena de río lavada previamente, eliminando así la posibilidad de que interfiera con el experimento. Así, se constituye el sustrato neutro sobre el cual se sembrarán las plantas. En estas macetas, se sembró dos semillas de una especie, para asegurar la germinación de, al menos, una semilla por maceta. Así, se trabajó con nueve macetas con sustrato de arena de río con individuos de B. vulgaris y otras nueve con individuos de S. oleracea. Se regó diariamente con agua de pozo hasta lograr la germinación. Al cabo de este periodo, se procedió a regar la plántula con media dosis de solución nutritiva (se usará la solución nutritiva La Molina®): 2,5 mL de Solución A La Molina® y 1 mL de Solución B La Molina® completando con agua de pozo un litro de solución. Este segundo riego fue prolongado por una semana, periodo tras el cual se procedió a regar con una solución a dosis completa: 5 mL de Solución A y 2 mL de Solución B La Molina® completando con agua los 1000 ml, según las especificaciones de uso. Este tercer riego duró dos semanas, al cabo de las cuales se tuvo las plantas listas para ser sometidas a los tratamientos experimentales. Este experimento se llevó a cabo en el módulo hidropónico del Centro de Investigación de Hidroponía y Nutrición Mineral de la Fundación para el Desarrollo Agrario, en la Universidad Nacional Agraria La Molina. Esta programación fue hecha en el aula de clase (Laboratorio de Fisiología Vegetal B-4), de manera teórica, el miércoles 31 de agosto de 2011, por el profesor del curso.

Tratamientos experimentales: sobre cada grupo de macetas se aplicó tres tratamientos: un tratamiento control, que fue regado con solución nutritiva de dosis completa, mientras que los otros dos fueron tratados con solución nutritiva más cloruro de sodio (NaCl), el cual se usó para aumentar la conductividad eléctrica de la solución de riego hasta 3 y 3,5 dS/m, respectivamente para cada tratamiento. Esta se determinó de manera directa gracias a un multímetro. De esta manera, se obtuvo seis bloques con tres repeticiones cada uno, donde se evaluará sobre cada especie los tres tratamientos experimentales. Se puede mostrar esto de manera esquemática a través de un croquis experimental:







Bloque







1

2

Tratamiento

S. oleracea

B. vulgaris

C

Control (CE 2,2 dS/m)

Repetición 1C1

Repetición 1C2

Repetición 2C1

Repetición 2C2

Repetición 3C1

Repetición 3C2

1

CE = 3 dS/m

Repetición 111

Repetición 112

Repetición 211

Repetición 212

Repetición 311

Repetición 312

2

CE = 3,5 dS/m

Repetición 121

Repetición 122

Repetición 221

Repetición 222

Repetición 321

Repetición 322

Tabla 1.1: Croquis experimental Fuente: Elaboración propia

Análisis estadístico: Se empleó una evaluación descriptiva de los resultados, empleando gráficos comparativos para los tratamientos y bloques.

3. Desarrollo

Se instaló el experimento según lo programado, al tiempo que se designó el cronograma de riegos diarios para las macetas entre todos los estudiantes. Las semillas se sembraron el miércoles 7 de setiembre de 2011, y se dio inicio así al experimento.


Figuras 1.1 y 1.2: Experimento instalado
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Se esperaba que las plántulas nacieran en un lapso aproximado de 1 semana; sin embargo, se esperó tener 9 plántulas de cada especie antes de iniciar los tratamientos experimentales, debido a que, luego de una semana, se verificó que solo habían germinado ocho plántulas de S. oleracea y cuatro de B. vulgaris. Además, se determinó las cantidades de NaCl necesarias para elevar la salinidad de la solución nutritiva, que tiene una salinidad considerada natural aproximada de 2,1  2,2 dS/m (Rodríguez, comunicación personal), hasta los valores deseados para los tratamientos. Se concluyó que los valores requeridos para elevar la conductividad eléctrica de un litro de solución nutritiva hasta 3 y 3,5 dS/m son, respectivamente, 8 y 14 milimoles por litro (mmol/l).


De izquierda a derecha: figura 1.3: Supervisando las plántulas. Figuras 1.4 y 1.5: cotiledones de S. oleracea.

Figuras
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Luego de 5 semanas de riego se obtuvieron plantas estresadas que podían ser evaluadas. Así, se observó el contenido de clorofila en todos los tratamientos y se evaluó la cantidad de nitrato reductasa en las plantas de B. vulgaris.

Sobre las clorofilas en plantas estresadas y la evaluación del contenido de clorofilas: Numerosos estudios que comparan la concentración total de clorofilas, así como la razón entre clorofilas a y b dan constancia de que la planta reacciona efectivamente alterando su fisiología de fotosíntesis. Modelos para estos ensayos son Phaseolus vulgaris, Lactuca sativa, y muchas veces presentan resultados disímiles para un mismo estudio: González, Pastenes y Horton (2001) reportaron para diferentes variedades de frejol comportamientos diferentes: mientras que unos aumentaban su clorofila total, otros cultivares la disminuían. De cualquier modo, se puede observar la tendencia al aumento de clorofila b con respecto a la a, disminuyendo la proporción a/b (González et al, loc. cit.; Masalías, del Río, Martínez, Dasnoy, s. d.). Además es interesante observar que Masalías et. al. reportan valores crecientes de concentración de clorofila conforme el estrés es más severo, para S. oleracea, lo que sienta pautas para los resultados de este experimento

Metodología: Para el presente ensayo se empleó la metodología de Lichtenthaler y Welburn (1983, citados por Saupe, 2009) modificada a las condiciones locales, que consiste en la extracción de clorofilas empleando acetona al 80%, para luego evaluar la absorbancia de la solución en un espectrofotómetro de espectro visible a 663 y 443 nm (a diferencia del procedimiento original que emplea 445 nm). Además, si el valor recabado supera a 1, se disuelve toda la serie en acetona al 80% en una proporción 1:4 hasta alcanzar los valores iguales o menores que uno. Esta disolución se hizo dos veces en el presente experimento, para todos los bloques. Cabe destacar que los protocolos conseguidos también estipulan métodos de medición de carotenoides y antocianinas, que no son evaluados por no ser relevantes en este ensayo. Finalmente, con los valores obtenidos se aplica las fórmulas estipuladas en el protocolo a seguir (v. Anexo 1):

Clorofila a (µg/ml) = 12.21 (A663) – 2.81 (A646)
Clorofila b (µg/ml) = 20.13 (A646) – 5.03 (A663)

Para la corrección de valores obtenidos, se toman los valores más cercanos entre sí y se promedian, reemplazando a los valores outsiders. Igual corrección se empleará para todos los tratamientos.

Sobre el metabolismo del nitrógeno (modificado de la Facultad de Agronomía de la Universidad de la República [Díaz et al., 2004; Monza s. d., Viega et al., s. d.]) y la evaluación de la nitrato reductasa: Las plantas absorben NO3 desde el suelo y son capaces de mantener concentraciones mayores de este ion en sus células o en la savia del xilema. Para esto, el NO3 atraviesa la membrana plasmática de las células epiteliales de la raíz mediante transportadores específicos con gasto de ATP. En la mayoría de las plantas existen dos tipos de transportadores; los constitutivos con una KM1 alta para el NO3, y los inducibles con una KM baja: son transportadores de baja y alta afinidad respectivamente. Una evidencia acerca de la existencia de transportadores inducibles por el NO3, es que la absorción de este ion desciende en presencia de inhibidores de la síntesis proteica. El transporte de NO3 es dependiente de ATP, por lo que decrece con bajas presiones de O2 en el entorno radicular, así como en presencia de inhibidores o desacopladores de cadena respiratoria.

El NO3 puede ser reducido en las células de las raíces, o bien en tallos y hojas. La contribución relativa de los distintos órganos en la reducción del NO3 varía con la especie: en plantas tropicales la reducción ocurre preferentemente en el tallo y en las hojas, y en las de clima templado en las raíces. A nivel celular, las plantas en general acumulan el NO3 en la vacuola, para lo cual debe ser transportado a través de la membrana vacuolar o tonoplasto. La reducción de NO3 a NH4 es un proceso que ocurre en dos reacciones consecutivas: una citoplasmática catalizada por la enzima nitrato reductasa que reduce el nitrato a nitrito y otra de los plastos, catalizada por la nitrito reductasa que reduce el nitrito a amonio.



Figura 1.6: Diagrama de la absorción del nitrógeno. Fuente: Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria de Uruguay

La nitrato reductasa del citosol usa NADH+H o NADPH+H como donador de electrones, mientras que la Nitrito reductasa que es una enzima localizada en plastos, emplea ferredoxina reducida (Fd red) o NADPH+H. Cuando a una planta se le suministra NO3, aumenta la cantidad y actividad de proteína nitrato reductasa en hojas y raíces. El aumento de la cantidad de NITRATO REDUCTASA se debe a la síntesis de novo de la enzima, y en plantas es uno de los ejemplos más conocidos de inducción de la síntesis de una enzima por su sustrato. La Nitrito reductasa, codificada por un gen nuclear, es sintetizada en el citoplasma como una proteína precursora, y tiene una secuencia N-terminal que corresponde a un péptido señal que determina su ingreso al los plastos.

La asimilación de nitrógeno consiste en la incorporación del NH4 a moléculas orgánicas. El NH4 puede ser absorbido como tal, de la reducción del NO3 que las plantas absorben, o del N2 atmosférico que bacterias asociadas a plantas son capaces de reducir. En los tejidos vegetales prácticamente la totalidad del nitrógeno es asimilado por una reacción catalizada por la enzima glutamina sintetasa (GS), seguida de otra reacción catalizada por la glutamato sintasa (GOGAT), una amidotransferasa.



Figura 1.7: Reacciones de la reducción del nitrógeno, indicando sus localizaciones. Fuente: Manual de prácticas de Fisiología Vegetal de la Facultad de Agronomía de la Universidad de la República del Uruguay


Para hacer 100 ml de reactivos para nitritos:

  • Mezclar 3.8735 ml de HCl al 37% (ρ= 1.19 g/cm3) y se completa con agua destilada hasta los 50 ml. Luego, se disuelve 0,5 g de sulfanilamida en la solución.

  • 0, 01 g de N-(1-naftil)-etilén-diamín-dicloruro en 50 ml de agua destilada. Mezclar.


La GS cataliza la incorporación del NH4 al glutamato para dar glutamina en una reacción que requiere ATP. El bajo KM de la GS para el NH4 asegura su inmediata asimilación, lo que evita que este ion toxico quede libre en la célula. La reacción que sigue es catalizada por la GOGAT, enzima que utiliza como cofactores al NAD(P)H+H o ferredoxina reducida. En esta reacción el grupo amida de la glutamina es transferido al cetoglutarato para dar dos moléculas de glutamato. Un glutamato es un aceptor de NH4 cerrándose así el ciclo GS/GOGAT y el otro glutamato se usa para la síntesis de aminoácidos mediante aminotransferasas. Ecológicamente, la “vitalidad” del nitrógeno en un ecosistema puede determinar su salud (Suárez et al. 2008)

Metodología: Para el presente ensayo, se tomaron muestras según el protocolo de la determinación de nitrato reductasa de la cuarta práctica del curso “Fisiología del Estrés” (Calderón, s. d.), es decir, el protocolo de Neyra y Hageman modificado por Álvarez y Felman. Este consiste en los siguientes procesos: se pesa medio gramo de hojas de la especie a estudiar (cuidando que la muestra no tenga nervaduras); y se desmenuza a tamaños menores de 5 mm. Se colocan en viales con solución incubadora y se deja reposando por una hora, a temperatura controlada (30 – 32° C). Al finalizar la incubación, se toman alícuotas de 100 de la solución incubada y se coloca en un tubo de prueba. Se agrega 2 ml del reactivo de nitritos y se completa con 5 ml de agua destilada. La mezcla toma un color púrpura característico, y se evalúa en un espectrofotómetro de espectro visible a 540 nm. Con los datos obtenidos se resuelve la siguiente fórmula para hallar la cantidad de nitritos producidos por gramo de peso fresco de material vegetal, lo que nos permite evaluar, indirectamente, la actividad (y por ende la cantidad) de nitrato reductasa:

Número de μmol de NO2- / Peso freso (en mg) = 0.1 × DO × 1/alícuota (en l × 10-4) × 1/peso (en mg) × Tiempo de incubación (en minutos) × Volumen (en ml)

Así, se obtienen valores que son las variables independientes de la densidad óptica, lo que nos permite elaborar una curva estándar.
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