Determinacion de creatinina en suero (creatininemia) y orina (creatininuria) de diferentes especies animales




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fecha de publicación16.01.2016
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GUIA DE LABORATORIO - BIOQUIMICA - AÑO 2010

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - UNNE


LABORATORIO Nº 2

En esta instancia se realizarán las determinaciones que figuran en esta guía además de la

demostración de la existencia de almidón en papa y la reacción de hidrólisis del almidón en tubos (ver Guia LAB 1)
METABOLISMO DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS
DETERMINACION DE CREATININA EN SUERO (CREATININEMIA) Y ORINA (CREATININURIA) DE DIFERENTES ESPECIES ANIMALES.

La creatina es un derivado de la glicocola, la arginina y la metionina, fabricado en el hígado, de interés en el metabolismo muscular, ya que como fosfocreatina constituye una forma de almacenar energía que puede ser usada para reconstituir el ATP a partir de ADP por acción de una enzima que transfiere grupos fosfato, la creatinoquinasa (2.7.3.1.) ó CK, también conocida como creatin-fosfo-quinasa ó CPK. El ATP es el compuesto dador de energía para la contracción muscular, en el proceso pierde un fosfato quedando como ADP. Este se puede regenerar en parte gracias a la presencia en el músculo de fosfocreatina, según:

CREATINA + ATP Û FOSFOCREATINA + ADP


NH2

½

HN=C-N-CH2-COOH

½

CH3
La creatinina es un derivado de ciclización de la creatina, formada cada día, proporcionalmente a la masa muscular del sujeto, con pérdida de fosfato. Es un producto de desecho pues ya no sirve como dador de fosfatos al ADP y se elimina por orina.

/NH2-CO

HN=C ½

\N-----CH2

½

CH3
La creatinina es un compuesto sumamente difusible cuya eliminación se efectúa casi siempre por filtración en el glomérulo renal por lo que el aclaramiento plasmático de esta sustancia (cantidad que se elimina de un volumen de plasma en un tiempo dado) se usa frecuentemente para medir la filtración glomerular (mililitros por minuto de líquido filtrado desde el plasma que pasa a los túbulos renales donde se forma la orina). Para calcular el aclaramiento plasmático o clearance de creatinina es necesario medir sus concentraciones en plasma y en orina en un período de 24 horas en que se colecta la muestra de orina.

Las mediciones de la concentración y del clearance de creatinina se emplean para evaluar la función renal. La concentración será mayor a la normal y el clearance será menor cuando los riñones no logren eliminarla del organismo o cuando las vías urinarias inferiores estén obstruidas y no pueda eliminarse la orina.
Fundamento de la determinación colorimétrica de creatinina en suero y orina

La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinización con ácido pícrico, obteniéndose un cromógeno que se mide a 510 nm.
Muestras: a) suero separado de las células sanguíneas, que se conserva refrigerado a 2-10ºC y se debe procesar dentro de las 24 horas. b) orina colectada durante 2 ó 24 horas y conservada en refrigerador a 2-10ºC, debiendo procesarse dentro de los cuatro días, diluyéndola 1:50 con agua destilada.

Procedimiento: con los reactivos provistos por el equipo comercial:

Realizar la desproteinización del suero de la siguiente manera: a 0,7 ml de suero agregar 3,5 ml de ácido pícrico (Reactivo 1) Mezclar por inversión. Dejar reposar 10 minutos y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos como mínimo.

Colocar en cuatro tubos de hemólisis marcados: “B” Blanco, “St”=Estándar, “D”=Desproteinizado de suero de mamífero monogástrico,”Om”=orina de mamífero (dilución 1:50):


Tubos

“B”

“St”

“D”

“Om”

Standar(ml)

-

0.25

-

-

Muestra(ml)

-

-

1.5

0.25

Agua dest.(ml)

0.5

0.25

-

0.25

Reactivo 1(ml)

1

1

-

1

Reactivo 2*(ml)

0.5

0.5

0.5

0.5


Mezclar por inversión. Incubar todos los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Leer en fotocolorímetro a 500 – 540nm (510nm); llevando a 100% de transmitancia con agua destilada.

Corregir las lecturas “St”, “D”, y “Om” restándole la lectura del tubo “B”.

Efectuar los cálculos teniendo en cuenta que la concentración de creatinina en el Estándar es de 20 mg/l, de la siguiente forma:

Concentración de creatinina en suero (mg/l):

20 mg/l x Absorbancia de “D” /Absorbancia dl “St”

Concentración de creatinina en suero (g/hs):

20 mg/l x Absorbancia de “Om” x 50 x V / Absorbancia de “St”

donde 50 = factor de dilución y V es el volumen de la diuresis( litros / horas)

Resultados: los valores en suero variarán con la especie animal. En el ser humano oscilan entre 8 y 14 mg/l. En la orina su concentrción es más elevada. El hombre elimina unos 0.9 a1.5 g/24hs.
* Reactivo 2: contiene buffer glicina / NaOH con un pH de 12,4
Informe Laboratorio 2
COMISIÓN Nº FECHA:
NOMBRE/S Y APELLIDO/S:


Téngase en cuenta que:

Fundamento del ensayo” hace referencia al soporte teórico de la experiencia deberá ser breve, por ej. “El Cu++ del reactivo se reduce en medio alcalino por acción de compuestos reductores como la vitamina C”.

Los “Resultados observados” son las observaciones que se producen mientras se desarrolla la prueba (color, presencia de coágulos, precipitados, etc).

La “Interpretación” es la justificación que Ud. le da al resultado obtenido según el fundamento argumentado (ej. prueba positiva por la presencia en la muestra de jugo de cítricos de ...)


Reacción



A.A - Proteínas





1

Nombre







Fundamento








Resultado







2

Nombre








Fundamento








Resultado







3

Nombre








Fundamento







Resultado









BIOSEGURIDAD:
Riesgos químicos:

ACIDO PICRICO: El trinitrofenol (T.N.P.), también denominado ácido pícrico, de fórmula química C6H2OH(NO2)3, es un explosivo que se utiliza como carga aumentadora para hacer explotar algún otro explosivo menos sensible como el T.N.T

HIDROXIDO DE SODIO:

Riesgos:

Ingestión: puede causar daños graves y permanentes al sistema gastrointestinal.

Inhalación: Irritación con pequeñas exposiciones, puede ser dañino o mortal en altas dosis.

Piel: Peligroso. Los síntomas van desde irritaciones leves hasta úlceras graves

Ojos: Peligroso. Puede causar quemaduras, daños a la córnea o conjuntiva.

Peligrosidad:

Biológico: 3

Inflamabilidad: 0

Reactividad: 1

Riesgo fuego:

En estos laboratorios trabajaremos con mecheros de Bunsen por lo que tendremos que tomar las medidas necesarias para evitar quemaduras e incendios.
Riesgos Biológicos:

SALIVA, TEJIDOS, SUERO Y ORINA: Siempre que manipulemos material biológico debemos tomar ciertas precauciones como el uso de guantes, barbijos, antiparras, guardapolvos o delantales y evitar ingestión y contacto


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