Trabajo práctico nº 7: aislamiento de acido desoxirribonucleico




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fecha de publicación04.11.2015
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

QUÍMICA ORGANICA


INGENIERÍA BIOMÉDICA










TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

Objetivos:

-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-pro­teína) a partir de timo de ternera

-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y pro­teínas

-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.

-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.

Introducción

ELECCION DEL TEJIDO
Con el objeto de elegir tejido biológico adecuado para la obtención del ADN, se deben considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:
1) Elevada concentración de ADN.

2) Mínima relación ARN/ADN

3) Baja actividad de ADNasa.

4) Elevado contenido ADN/órgano.

5) Fácil disponibilidad.

6) Bajo costo.

1) Elevada concentración de ADN.
Casi todas las células contienen ADN; excepcionalmente, algunas de ellas carecen de núcleo y también de ADN, como en el caso de los glóbulos rojos de los mamíferos.

En las células nucleadas, la cantidad de ADN varía notablemente en los diferentes tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una rata adulta:

TEJIDO

µg de ADN/100 mg de tejido fresco


músculo esquelético

57

cerebro

123

testículo

230

hígado

240

vesícula seminal

254

corazón

306

riñón

324

páncreas

480

pulmón

710

intestino delgado

1290

bazo

1400

médula ósea

1530

timo

2760



En esta tabla se observa que, en la rata adulta el órgano más rico en ADN es el timo (concentraciones algo menores se encuentran en la médula ósea, el bazo y el intestino delgado.).

2) Mínima relación ARN/ADN:
La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por tratarse de compuestos estrechamente relacio­nados desde el punto de vista químico.

En general las células vivas contienen una cantidad de ARN con­siderablemente mayor que la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relación ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las células espermáticas que están casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como varía esta relación en los diferentes tejidos de la rata adulta:


TEJIDO

ARN/ADN

hígado

3,68

glándula sub-maxilar

1,73

riñón

1,08

bazo

0,335

tejido linfoide

0,285

timo

0,195


Bajo este aspecto, también el timo se encuentra en las mejores condiciones.

3) Baja actividad de ADNasa
Los extractos de distintos tejidos como el hígado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene específicamente en la degradación del ADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente específica. Para su acción esta enzima requiere la presencia de ca­tiones bivalentes; los activadores más específicos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la acción que producen.

Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonu­cleasa en los tejidos puede evitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los agentes que­lantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato, fuertemente inhibidores a una concentración de 0,001 M y el borato a 0,02 M.

4) Elevado contenido en ADN/órgano.
Es muy importante que la concentración del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el punto de vista práctico, el material biológico será más ventajoso si la cantidad total del ADN en el órgano es tambi­én alta. Daremos un ejemplo:

Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el órgano de la rata que reúne las mejores condiciones para la obtención de ADN; pero éste es un órgano pequeño: pesa aproximadamente 33 mg, por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de ternera la concentra­ción del ADN es aproximadamente la misma (2250 µg ADN/100 mg de tejido), pero tiene un tamaño mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden obtener de él más de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberían sacrificar unas 100 ratas adultas.

5) Fácil disponibilidad:
No basta con que el material biológico reúna todas las caracter­ísticas que vimos anteriormente; es necesario también que sea fácil de obtener en el momento que se necesite. Por ejemplo, el esperma de salmón tiene casi exclusivamente ADN y constituye una excelente mate­ria prima, pero no es fácil de conseguir. A su vez, el timo de ternera se con­sigue con mucha facilidad en nuestro país que es típicamente ganadero, pero en EEUU no ocurre lo mismo y resulta más sencillo de conseguir el bazo de cerdo. Es decir, que la elección del tejido depende del lugar donde se trabaja por las posibilidades que se ofrecen de conseguirlo con mayor facilidad.
6) Bajo costo:
En nuestro país el timo de ternero puede conseguirse gratuita­mente en los mataderos, porque constituye un material de desecho.

CONCLUSION: para obtener ADN en nuestro laboratorio elegimos el timo de ternera vulgarmente llamado molleja de cuello porque reúne todos los requisitos enumerados.

AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA
El método consta de los siguientes pasos:
1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-pro­teína).

2) Disociación del complejo en sus dos componentes: DNA y pro­teínas.

3) Eliminación de las proteínas.

4) Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.

5) Disolución del desoxirribonucleato de sodio obtenido.

FUNDAMENTO.
1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-proteína).
El propósito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los complejos nucleoprotéicos que se encuentran presentes en el timo de la ternera: la ribonucleoproteína (RNP) y la desoxirri­bonucleoproteína (dRNP).

Esta separación se consigue homogeneizándo el tejido en una solución salina de baja fuerza iónica (NaCl: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la estabilidad de ambos complejos y disuelve a la mayor parte de las moléculas que se encuentran presentes en el timo (inclu­so la RNP) pero no disuelve a las dRNP. En el método elegido se utili­za una solución isotónica (NaCl 0,15 M = 0,9 %).

Los métodos de baja fuerza iónica son adecuados para el aislami­ento de las dRNP; sin embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberación de las nucleasas; estas enzimas producen la degradación enzimática parcial de los ácidos nucleicos y requieren, para su ac­tividad la presencia de ciertos cationes bivalentes (Mg++, Mn++, Fe++ y Co++). Para evitar este inconveniente, la homogeneización se realiza en presencia de agentes quelantes como el EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del medio los cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas enzimas. En el método que elegimos se utiliza el citrato para complejar los ca­tiones (citrato de sodio 0,015 M).

Si se quiere mantener la integridad de la molécula de ADN es necesario verificar que las soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a pH 7. Es también sabido que los ácidos, a pH infe­rior a 2 producen la ruptura del enlace N-glucosídico de las purinas dando orígen al ácido apurínico. A pH alcalino se produce la desnatu­ralización del ADN o sea la ruptura de los puentes hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas polinucleotídicas.

También se recomienda agregar algunas gotas de alcohol octílico normal, porque evita la formación de espuma y produce hemólisis con lo cual se facilita la eliminación de la hemoglobina del tejido.

Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a 5°C) se inhibe la ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo de la glándula y que actúan sobre el DNA produciendo la degradación de su molécula. Por ese motivo en esta primera etapa todos los pasos deben realizarse en frío (0 a 5°C), aunque se trabaje en presencia de inhibidores.

Los dos tipos de nucleoproteínas (RNP y dRNP) que se encuentran presentes en el homogenato, diferenciables por su distinta solubili­dad, pueden separarse por centrifugación en frío; se obtiene un preci­pitado formado por el material insoluble en la solución salina (dRNP) y un sobrenadante que contiene el material soluble en esa solución (RNP).

En conclusión:


Sobrenad (RNP)



(SSC-1X)

Timo ______________Homogenato ____________________ Centrifugado




Precip (dRNP)




(RNP y dRNP) RNP (sol.) dRNP (insol.)


Resuspender y trabajar a volumen total

susp. y homogenización

SSC-1X = (Solución de ClNa 0,15 M- Citrato de Na 0,015 M a pH 7).
2) Disociación del complejo en sus dos componentes : DNA y proteínas.
La homogenización del tejido con solución SSC-1X y la centrifuga­ción posterior posterior, realizadas en la primera etapa, han permiti­do aislar el DNA del timo de ternera combinado por proteínas en forma de un complejo: Desoxirribonucleoproteínas (dRNP).

El propósito de esta segunda etapa es disociar el complejo aisla­do, liberando el DNA (como desoxirribonucleato de sodio) de las pro­teínas que lo acompañan.

Esta disociación se consigue mediante el empleo de SDS (Lauril sulfato de sodio o dodecil sulfato de sodio) reactivo que en presencia de clorurode sodio, disocia el complejo desoxirribonucleoprotéico y precipita las proteínas liberadas sin producir la depolimerización del nucleato.
3) Eliminación de las proteínas.
Las proteínas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con SDS se eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1), que las desnaturaliza y coagula.

La preparación cruda de ADN se agita vigorosamente con clorofor­mo-alcohol isoamílico. La emulsión resultante se centrifuga en frío para acelerar la separación de las fases. Se separan dos faces bien definidas separadas por una interfase sólida; ellas son:

1-Fase Orgánica: (Cloroformo - alcohol isoamílico) se separan en el fondo del tubo y contiene los compuestos lipídicos.

2-Fase acuosa: sobrenada en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio del ADN y nucleoproteína.

3-Interfase sólida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores; está constituída por el gel que se forma entre el clorhidrato de proteína y la mezcla de cloroformo - alcohol isoamíli­co.
4) Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.
El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso que puede ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite separar el ADN de otras macromoléculas que coagulan de una manera no fibrosa, como por ejemplo el RNA y las proteínas.
5) Disolución del desoxirribonucleato de sodio obtenido.
La sal de sodio del ADN es fácilmente soluble en agua destilada y en soluciones de baja fuerza iónica.

ACIDOS NUCLEICOS II: ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)
OBJETIVOS:
1) Separar el ácido desoxirribonucleico del ácido ribonucleico a partir de un tejido animal, a través de sus propiedades diferenciales de solubilidad.
2) Obtener el ADN puro por precipitación.
I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO
Pesar 15 gr. de timo en una cápsula de Petri y cortar con un cuchillo o navaja en láminas delgadas; colocar el tejido desmenuzado en un vaso homogeneizador de 100 ml de capacidad y se le agregar 45 c.c. de citrato de sodio 0,015 M y 45 c.c. de cloruro de sodio 0,15 M. Tomar el pH y elevar a pH 7 con Tris. Enroscar el vaso en la tapa que lleva la cuchilla (ver figura) haciéndola girar en sentido contrario a las agujas del reloj. Todo el equipo se hace descender (aflojando el tornillo 2) hasta que el vaso queda bien sumergido en hielo picado.

Mover el control de velocidad (tornillo 1) lentamente hasta llegar a 5.000 r.p.m. y en ese punto dejar durante 3 minutos. Una vez cumplido el tiempo, llevar el control a cero, elevar todo el equipo, hasta que el vaso queda fuera del hielo y desenroscar el vaso. Se obtiene una suspensión de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.

Centrifugación:
Verter el homogeneizado en tubos de centrífuga y centrifugar en frío (5ºC) durante 5 minutos a 5.000 r.p.m.. Se obtiene un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.

II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO:
Colocar en un Erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y agregar 30,75 ml de Citrato de Sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml. de solución de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 5% en etanol al 45%. Sucesivamente agregar siguiendo el orden que se indica y mezclar bien después de cada adición, 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml. de ClNa 2 M y 3,78 ml de Citrato de Sodio 0,015 M (para completar 105 ml.)

III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:
En una ampolla de decantación colocar la suspensión obtenida y agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsión resultante en tubos de centrífuga y se centrifuga en frío (5ºC) du­rante 10 minutos a 5000 r.p.m.. Retirar los tubos suavemente de la centrífuga para mantener la separación de las fases. Con una pipeta

capilar retirar la capa acuosa superior que contiene la sal de sodio del DNA tratando de no perturbar la fase proteica.
IV-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO:
En un recipiente de telgopor colocar hielo picado y sobre el mismo, un vaso de precipitación que contiene la capa acuosa despro­teinizada. Medir dos volúmenes de etanol al 95% frío y vertir lenta­mente sobre las paredes del vaso tratando de formar una capa alcohóli­ca sobre la fase acuosa viscosa. Con una varilla de vidrio gruesa agitar la solución de ADN con un movimiento de rotación suave y contí­nuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla.

Cuando el etanol se vuelve límpido, signo de que ya se ha enros­cado todo el ADN, retirar la varilla del líquido y presionar las fibras de ADN sobre las paredes del vaso de precipitación para expri­mir el exceso de solvente.

Eliminar el líquido residual apoyando la varilla sobre un papel de filtro. Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga éter etílico. Retirar el ADN de la varilla y colocar en un vidrio de reloj dejar secar 10 minutos para eliminar por completo el solvente.

BIBLIOGRAFIA

QUIMICA ORGANICA DE FINAR, VOL II.

BIOQUIMICA DE LEHNINGER.

BIOQUIMICA DE STRYER, VOL I.

BIOQUIMICA DE NIEMEYER, VOL I.-






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