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Universidad Central del Ecuador

Facultad de Ciencias Químicas

Escuela de Bioquímica y Farmacia
Nombre: María Fernanda Bustos Matuhura

Grupo: B6

Fecha: 18 de abril de 2011
CONSULTA

Dispersión de la Luz

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión.

Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos, por ello, una suspensión bacteriana aparece turbia a simple vista. Dentro de un rango, la luz absorbida o dispersada por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. Por ello, un procedimiento rápido, fácil y preciso de estimar el número de bacterias en un cultivo es la medida de turbidez. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para medir la turbidez. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida (normalmente las longitudes de onda usadas para medir la turbidez bacteriana están en el rango 540 – 660 nm).

DENSIDAD ÓPTICA

La cantidad de luz incidente absorbida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica y se expresa como absorbancia o densidad óptica. Así la absorbancia se define como la proporción de luz incidente absorbida por una suspensión y se puede calcular como: la luz absorbida / luz incidente.

TURBIDIMETRIA

La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo.

Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

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Absorbancia en función del Peso Seco


Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbidimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que permiten la realización de medidas sin necesidad de abrir los matraces y de tomar muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.

Hay que tener en cuenta que existe un límite de detección en cultivos con concentraciones inferiores mínimo de detección con concentraciones inferiores a 106 UFC/ml no presentan turbidez detectable

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

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Absorbancia en función del Peso Seco


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Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

Mediciones de absorbancia

Si medimos la absorbancia de un cultivo a distintos intervalos de tiempo, la curva relaciona los parámetros que representa una curva de crecimiento de población bacteriana con sus distintas fases. La primera fase se denomina fase de latencia, en la que la bacteria se adapta a las condiciones de cultivo y el número de células no aumenta. Tras este período las bacterias comienzan una fase de crecimiento exponencial en la que la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de duplicación constante, por lo que las bacterias en esta fase son las más indicadas para estudios enzimáticos, estructurales, etc .

Esta fase de crecimiento disminuye por algún factor limitante. Entonces, la velocidad de crecimiento disminuye y la población comienza un período de equilibrio que se denomina fase estacionaria, en cual se producen fenómenos tan peculiares como la esporogésis o la producción de antibióticos. Por último, si se mantiene el cultivo durante más tiempo en esta situación comenzará un proceso de muerte en el que número de células viables disminuye: fase de muerte.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

Una aplicación directa de la turbidimetría es la realización de una curva patrón en la que se realciona la medida de absorbancia con el número de células viables del cultivo. Simultáneamente a las medidas de absorbancia se realizan recuentos en placa. De esta forma, a partir de la absorbancia de un cultivo podemos extrapolar de la curva patrón el número de bacterias viables.

ESCALA DE McFARLAND

Como se ha comentado anteriormente, una aplicación directa de la turbidimetría y del recuento de microorganismos por diluciones seriadas es la realización de una curva patrón en la que se relaciona la medida de la absorbancia con el número de células viables del cultivo. Sin embargo, una mayor simplificación la ofrece la estandarización de McFarland, útil en análisis microbiológicos sencillos. La escala de McFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato bárico (mezcla de cloruro bárico al 1% y ácido sulfúrico al 1%) con el número de bacterias presentes en una muestra. Así, por ejemplo, como se muestra en la tabla 1 si la muestra presenta la misma turbidez que el patrón 1 de la escala McFarland, la carga será aproximadamente de 3x108* UFC/ml.

Tabla 1 Preparación e interpretación de la escala McFarland

Escala McFarland

BaCl2 al 1% (ml)

H2SO4 al 1% (ml)

UFC/ml (x108)

1

0,1

9,9

3

2

0.2

9,8

6

3

0,3

9,7

9

4

0,4

9,6

12

5

0,5

9,5

15

6

0,6

9,4

18

7

0,7

9,3

21

8

0,8

9,2

24

9

0,9

9,1

27

10

1,0

9,0

30

Bibliografía:

  1. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioRecuento.htm

  2. Manual práctico de Microbiología, Carlos Gamazo y Eduardo López, España, 2005, p. 39

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