Protocolos actuales de congelacióN: ¿QUÉ y cómo congelar?




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títuloProtocolos actuales de congelacióN: ¿QUÉ y cómo congelar?
fecha de publicación21.08.2016
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PROTOCOLOS ACTUALES DE CONGELACIÓN: ¿QUÉ Y CÓMO CONGELAR?
MAYTE CAÑETE REINA. Bióloga Embryocenter

La criopreservación es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.

La criopreservación sería por lo tanto la congelación y almacenamiento de gametos y embriones.

De los embriones que se generan durante un ciclo de FIV o ICSI, pueden ser congelados:

-TODOS, por condiciones maternales adversas, cuando no es aconsejable transferir ningún embrión a la madre en ese ciclo concreto, porque exista, por ejemplo, un claro riesgo de hiperestimulación ovárica severa (un posible embarazo podría agravar la evolución del síndrome) o sencillamente porque se observe que el útero no está lo suficientemente receptivo en ese momento determinado (porque la paciente haya sangrado antes del día de la transferencia o porque el grosor o las características del endometrio sean inadecuadas).

-LOS NO TRANSFERIDOS, para que puedan ser utilizados en un intento posterior, bien para tener un segundo hijo, ó bien si el primer intento no da un resultado positivo.

INDICADA PARA:

  • Mujeres que por cualquier razón desean posponer su maternidad, por causas laborales o sociales

  • Pacientes oncológicas y no oncológicas que van a recibir tratamientos gonadotóxicos.

  • Mujeres que han recibido cirugía repetitiva sobre el ovario, como puede ser el caso de la endometriosis.

  • Banco de óvulos

  • Pacientes en las que preferiríamos realizar la transferencia embrionaria en un ciclo distinto al de la estimulación folicular (riesgo de SHO, aparición de pólipos, hidrosálpinx o hidrometras, ausencia de espermatozoides, etc).En pacientes con baja respuesta: para acumular ovocitos, o para tener una cantidad suficiente de ellos si el objetivo es realizar un ciclo de DGP.

Hasta hace relativamente pocos años, la técnica más empleada para la criopreservación de embriones fue la CONGELACION LENTA.

Los daños producidos por este método se deben principalmente a dos mecanismos:

-Congelación intracelular, suceso letal, sobretodo por la formación de cristales relativamente grandes.

-Efectos nocivos de la solución, q ocasionan daños en la membrana de la célula y orgánulos celulares por una alta concentración de electrolitos generados durante el enfriamiento lento.

El proceso se puede dividir en las siguientes fases

Precongelación:

Los embriones se exponen y equilibran a crioprotectores.

Los crioprotectores modifican las propiedades físicas de una solución por bajar su punto de congelación.

En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores:

PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Miyake y col., 1993).

IMPERMEABLES O EXTRACELULARES:De alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares (Kuleshova y col., 1999), estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua; deshidratan junto con el crioprotector las células de los embriones durante el equilibrio (Sommerfeld y Nieman, 1999).

Los crioprotectores previenen la deshidratación total y la degeneración proteica, causada por la congelación del agua intra y extracelular durante el proceso.

Los crioprotectores usados dependen de la fase en que esté el embrión:

-Blastocisto: Glicerol

-8 células: Dimetilsulfósido

-Pronúcleos: propanodiol ( se usa con sacarosa favoreciendo aún mas la deshidratación al ser éste un crioprotector impermeable)

Congelación

Pasos:

-Equilibrio de temperaturas entre la cámara de enfriamiento y el embrión

-Enfriamiento lento hasta llegar al punto de equilibrio de la congelación, por debajo del cual está la nucleación o formación del primer cristal de hielo, q comienza en el ambiente extracelular normalmente entre -5 y -15 ºC

-Superenfriamiento:Diferencia entre el punto de equilibrio y la nucleación, el cual se produce por una cristalización espontanea del medio y aumento de la temperatura debido al desprendimiento de calor latente.Éste puede bajar por “seeding” físico inducido, lo cuales la iniciación de la nucleacion a una temperatura controlada cerca del punto de equilibrio aprox 2ºC por debajo de su punto de congelación, tocando la pared exterior del tubo de muestra donde se encuentra el embrión con unas pinzas preenfriadas, lo cual enfria la solución localmente a una temperatura por debajo de -20ºC para q ocurra la nucleación espontanea.El agua superenfriada dentro de las células tiene un potencial químico más alto que en el exterior, parcialmente congelada, y en respuesta a esta diferencia en potencial, el agua fluye hacia fuera y se congela en el exterior.El embrión se comporta como un osmómetro y se deshidrata.Al producirse la nucleacion de forma lenta y controlada la producción de calor latente es prácticamente nula.

Almacenamiento

Descongelación: Debe hacerse a tasas por debajo de 40ºC por minuto

Durante el proceso, el embrión tiene q sufrir cambios múltiples en volumen como consecuencia de fuerzas osmóticas y puede responder a cambios en la composición de la solución extracelular dentro de ciertos límites.

En nuestro Centro utilizábamos una máquina de congelar PLANERKRYO 10 serie II versión 1.7,q contaba con una unidad de seeding automática para la congelación simultánea de 16 embriones mediante un modulo Peltier termoeléctrico q actúa como una bomba de calor, retirando el calor de la muestra y absorbiéndose éste por la columna central del autoseeder. Con ello, el aire de la muestra en contacto con la célula Peltier desciende localmente su temperatura 20ºC por bajada de a temperatura de la cámara, produciendo un superenfriamiento local e inducción a la nucleacion en ese punto.

En los últimos años hemos utilizado otra máquina llamada NICOOL MS21 con seeding manual.

Esta técnica inducía la formación de cristales de hielo en el interior de las células que producía su destrucción, por lo que aquellas células con un mayor contenido de agua, como son los ovocitos y los blastocistos, que pueden llegar a contener un 80 % de agua, no superaban el proceso de congelación y posterior descongelación. Esto no ocurría en el caso de los embriones desarrollados hasta día 2 o 3.

Hasta los años 90 en que se desarrollo el método de la vitrificación no se pudo comenzar a superar esta barrera.

Hace aproximadamente 8 años comenzamos a utilizar la técnica de la VITRIFICACIÓN, tanto de ovocitos como de embriones. En ambos casos los resultados, hasta ese momento desalentadores, alcanzaron unos resultados sorprendentes, de hasta el 42 % de embarazo con blastocistos desvitrificados.

El primer embarazo obtenido mediante esta técnica ocurrió en 2005.

La vitrificación es un método de congelación en el que, debido a la alta concentración de crioprotectores y ultrarrápida velocidad de enfriamiento, cuando se congela el sistema embrión-medio, las moléculas se disponen de manera similar a las del vidrio (tiene igual disposición molecular e iónica que el líquido), solidificando sin formación de cristales de hielo;ésta tiene ventajas frente a la congelación tradicional, pero el principal problema para la aplicación a gran escala ha sido el control estricto del tiempo de exposición de los embriones al crioprotector, ya que debido a la alta concentración requerida del mismo, existen problemas de disminución de la viabilidad embrionaria.  Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y, si es penetrante, bajo peso molecular para entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener el máximo efecto protector.

Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al máximo sus características deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes.

Dicha vitrificación se consigue mediante un enfriamiento muy rápido en el cual se utiliza una solución altamente concentrada que no cristaliza durante la congelación, en tanto que su viscosidad aumenta con el descenso de temperatura hasta la formación de un estado sólido amorfo. Para conseguir un gran cambio de temperatura a gran velocidad, se usa un volumen mínimo de medio ( menos de 0,1 microlitros).

Para conseguir que la deshidratación sea muy rápida se utilizan crioprotectores en concentraciones elevadas, la velocidad de congelación/descongelación es indirectamente proporcional a la concentración de crioprotectores. Antes de la congelación, el material biológico debe equilibrarse con esta solución crioprotectora (en menor concentración) para que pueda soportar el choque osmótico.

Los embriones suelen sobrevivir intactos (100% de las blastómeras), siendo útil tanto para embriones como para ovocitos, aunque empiezan a haber publicaciones de vitrificación de espermatozoides.

Se necesita una velocidad extrema en el proceso de desvitrificación, sacando la muestra del nitrógeno líquido e introduciéndola en medio a 37ºC.

VENTAJAS VITRIFICACION

-No hay cristalización del embrión.

-Utiliza altas concentraciones de crioprotector que disminuye el período de exposición del embrión a éstos.

-Proceso más rápido que la congelación lenta.

-El uso de pequeños volúmenes provee un incremento significativo en la tasa de enfriamiento.

-Tasas de enfriamiento entre 15.000 y 30.000ºC/min(0,3ºC/min en la congelación lenta)

-Se minimizan el daño por cambios osmóticos.

-Se reduce el tiempo del procedimiento (2-10´).

-Protocolo muy sencillo.

-Se eliminan los costos de adquisición de equipos.

-Al haber una mayor posibilidad de que un embrión implante, podemos transferir un menor número de embriones y con ello reducimos el riesgo de embarazo múltiple sin perder efectividad.

Pero la cantidad de sustancias crioprotectoras que se necesitan es mucho mayor que en la congelación lenta, por lo que se ha de reducir al mínimo el tiempo de exposición para no dañar las células.

Además, al haber una mayor posibilidad de que un embrión implante, podemos transferir un menor número de embriones y con ello reducimos el riesgo de embarazo múltiple sin perder efectividad.

USO DE LAS DOS TÉCNICAS
Congelación: dados los buenos resultados obtenidos con esta técnica desde hace años, en Embryocenter realizamos congelación lenta a embriones en estadio de desarrollo de día 1.
Vitrification:Desde ovocitos hasta embriones en cualquier estadio de desarrollo (desde día 2 hasta blastocisto).

EXPERIENCIA EN CONGELACIÓN LENTA/VITRIFICACIÓN

A continuación me gustaría mostrar la experiencia q tengo con los dos métodos a lo largo de los 26 años q llevo como embrióloga clínica en Embryocenter

En el año 1991 escribí un artículo en una revista que se entregaba a las pacientes sobre congelación lenta.

Asimismo también hice un Poster sobre vitrificación de triploides para el Congreso de Asebir en el año 2003

OBJETIVO: Probar el método de vitrificación en triploides para ver la viabilidad de éstos y poderlos aplicar en la práctica clínica.

MATERIAL Y MÉTODOS: Se emplearon 15 embriones en día +2 procedentes de zigotos triploides.Estos se expusieron secuencialmente a las soluciones de vitrificación que llevaban etilenglicol como crioprotector intracelular o penetrante, trehalosa como crioprotector extracelular o no penetrante de bajo peso molecular, para la deshidratación de las células, y hialuronato, crioprotector macromolecular para incrementar la viscosidad.

Se usaron pajuelas de congelación convencionales de 0.3 ml rellenadas con 30-50 microlitros de la gota de solución de vitrificación con los embriones.

Los embriones se almacenaron en nitrógeno líquido durante 30-60 minutos, y se descongelaron rápidamente en un baño a 37 grados centígrados.El contenido de las pajuelas se llevó a un medio tamponado con Hepes suplementado con 0.3 M de sacarosa.

RESULTADOS: 13 (86%) de los 15 embriones triploides preservaron una morfología normal en todas las blastómeras y no mostraron signos de daño tras la descongelación; 1 embrión (7%) tuvo una sola blastómera dañada combinada con 3-5 blastómeras supervivientes; 1 embrión (7%) tuvo viabilidad en menos de la mitad de sus células.12 embriones (80%) incluyendo el embrión con una sola blastómera dañada continuaron con la división celular.

CONCLUSIÓN: El método de vitrificación con hialuronato podría ser un eficiente y simple método de criopreservación en embriones humanos.

METODO ACTUAL DE VITRIFICACIÓN EN EMBRYOCENTER (AL HASANI):
PROTOCOLO VITRIFICACIÓN

Atemperar los medios 30 minutos a temperatura ambiente

ES: 100 - 200 µL

Ovocitos: 15 ´

Preembriones y embriones D +2 y +3: 6´

Mórulas y Blastocistos: 8´

VS: 100 - 200 µL 1´

A los 40 ´´ cargar con stripper en el criotop quitando todo el medio que sea posible, todos juntos y justo detrás de la marca negra. (Si hace falta tomarse más tiempo en cargar no pasa nada mientras se quite el medio).

Tirar rápidamente al Nitrógeno y ponerle el tapón dentro del nitrógeno

Se puede cargar hasta 5 ovocitos en un criotop; embriones poner 2-3.

Los volúmenes no hace falta que sean más de 100 o 200 µl .

Los ovocitos hay que vitrificarlos el mismo día de la punción
PROTOCOLO DE DESVITRIFICACIÓN

Atemperar el medio TS (1,0 M) a 37 grados y el DS en la placa calefactora durante 30 minutos (Tª amb)

TS: 1ML

Se sacan los ovocitos /embriones de la cántara y se pasan a una cubeta con nitrógeno.

Se saca el cryotop del tapón y se prepara para sacarlo en una esquina de la bañerita la cual estará lo mas pegada posible a la lupa.

Para sacar el cryotop de la bañerita, se traslada SIEMPRE bajo el nitrógeno hasta el borde más cercano a la lupa, para que así sea rapidísimo el paso del embrión al TS.

Se coloca en la placa (pasándolo al lado opuesto de donde hemos metido el cryotop) y se deja 1´

DS: 0.5 ML

Se pasan a este medio y se deja 3´

Se pasan por distintas gotas de lavado de medio de cultivo (unas 8 más o menos)

WS:0.5 ML

Se pasan a la placa de cultivo (CM/BM).
CONCLUSIONES

La vitrificación conjuga altas concentraciones de crioprotectores en un volumen mínimo y elevadas velocidades de congelación (15,000-30,000 °C/min),22 lo que genera como consecuencia la ausencia de cristales de hielo durante los procesos de congelación-descongelación, una mejor conservación de la ultraestructura y menor lesión de la fisiología ovocitaria y embrionaria.

La proporción de embarazo es similar a la comunicada para ciclos en fresco, de forma indistinta respecto de cuando se transfirieron embriones obtenidos a partir de ovocitos propios o donados vitrificados. Hasta el momento, los nacidos informados para la vitrificación de ovocitos parece tener una incidencia de anomalías congénitas (2.5%) no mayor a la comunicada para los nacidos de embarazos espontáneos en mujeres fecundas o de ciclos frescos de fecundación in vitro.

La vitrificación de ovocitos humanos proporciona elevada supervivencia ovocitaria, fecundación, desarrollo embrionario y embarazo. Es una técnica sencilla y altamente reproducible que puede beneficiar a parejas con necesidad de postergar la posibilidad de embarazo, incluidos las pacientes oncológicas.


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