Resumen en el laboratorio de microbiología se realizaron los pasos y se conocieron los requisitos mínimos para poder esterilizar y operar adecuadamente los implementos de trabajo, en la práctica 1 se conocieron los métodos de eliminación total de las bacterias que contaminan las herramientas de labo






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fecha de publicación25.11.2015
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RESUMEN

En el laboratorio de microbiología se realizaron los pasos y se conocieron los requisitos mínimos para poder esterilizar y operar adecuadamente los implementos de trabajo, en la práctica 1 se conocieron los métodos de eliminación total de las bacterias que contaminan las herramientas de laboratorio durante su uso como lo son cajas de petri; asas; probetas etc. También se realizo la preparación de dos tipos de agar en nuestro caso correspondió el agar Plate Count, utilizado para cultivar bacterias y el agar saboreaud para cultivar hongos. Una semana después en el laboratorio de microbiología se tomaron muestras de yogur, de la boca de un compañero, también se hizo muestreo de superficies en la sede de ingeniería ambiental, en manos de un compañero y otra al ambiente, por último se sembraron en los agares saboreau y plate count para cultivar las muestras anteriormente mencionadas. Ahora bien una semana después se revisaron las muestras y se hizo el reconocimiento morfológico de las bacterias cultivadas de yogur, boca, ambiente, superficie y manos a través de la tinción de gram y observando en el microscopio. Finalmente para la práctica siete se analizaron los hongos cultivados en la practica 2 y se hizo su respectiva identificación.

ABSTRACT

Palabras Clave: Esterilización, hongos, bacterias agar

Objetivo General

Realizar prácticas de laboratorio a través de las guías y especificaciones dadas por la profesora de microbiología.

Objetivos Específicos

  1. Esterilizar los materiales de laboratorio.

  2. Cultivar hongos y bacterias a través de los agares dados en la práctica.

  3. Realizar muestreos para aislar microorganismos.

  4. Preparar eficientemente agares para el cultivo de hongos y bacterias.

  5. Identificar las especies de hongos y bacterias encontrados en el laboratorio

Materiales Practica 1.1: Esterilización

  1. Papel Kraft

  2. Horno Eléctrico

  3. Cajas de petri

  4. Pipetas

Metodología Práctica 1: Esterilización

Se realizo la limpieza del mesón de trabajo con alcohol, después se tomaron tiras de papel Kraf y se envolvieron las pipetas con mucho cuidado de que quedaran bien empacadas, luego se envolvieron en grupos de 3 cajas de petri en fila una encima de otra y se envolvieron, observamos de que estuvieran bien envueltas, finalmente el material se marco con los nombres de los integrantes y se llevo el hasta el horno eléctrico que elimina todo tipo de vida incluidas las endoesporas a través de calor seco para esto se calibro la temperatura del horno a 160 grados centígrados que es la utilizada en la técnica de esterilización de material de laboratorio y se cronometro un tiempo de dos horas para la eliminación total de microorganismos que se encontrasen en ese momento en las cajas de petri y pipetas ya para finalizar con mucho cuidado se retiro el material con guantes y se dejo enfriar para su posterior uso.

Materiales Practica 1.2 Esterilización medios de cultivo

  1. Agua Destilada.

  2. Medio de cultivo Standard Plate Count Agar

  3. Medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar / Potato Dextrose Agar (SDA/PDA)

  4. Cajas de Petri.

  5. Frascos tapa rosca.

  6. Cinta indicadora.

  7. Balanza.

  8. Estufa.

  9. Autoclave.

Metodología Practica 1.2 Esterilización medios de cultivo

Los medios de cultivo para microorganismos se venden en forma deshidratada, de modo que su preparación implica únicamente mezclarlo con agua destilada, pesando la cantidad recomendada por el fabricante.

  1. Se peso la cantidad requerida del cultivo deshidratado de acuerdo a las instrucciones de la etiqueta.

  2. Se transfirió el polvo a un recipiente de vidrio resistente al calor se agrego el agua destilada medida en una probeta.

  3. Se calento el medio de cultivo hasta su ebullición.

  4. En el caso del PDA o SDA adicionar el cloranfenicol después de la ebullición, inmediatamente antes de ingresar el medio al autoclave.

  5. Se Coloco tapa rosca sin apretar, o papel aluminio, para esterilizar el medio en autoclave.

  6. Se coloco cinta indicadora sobre la tapa del recipiente.

PROCESO DE ESTERILIZACION

Con el fin de eliminar todos los microorganismos contaminantes y obtener el crecimiento únicamente de los organismos que nos interesan, los medios de cultivo son sometidos a un tratamiento térmico conocido como esterilización húmeda por medio de un equipo conocido como autoclave.

El autoclave es un equipo hermético que permite la entrada de vapor de agua a presión. El uso de calor húmedo permite la muerte de los microorganismos incluidas las endoesporas bacterianas. Experimentalmente se ha determinado que el tiempo requerido para matar las endoesporas bacterianas es de 10-20 minutos y la temperatura de 1210C, razón por la cual los autoclaves se han diseñado para alcanzar esta temperatura. El autoclave utiliza la presión para lograr esta temperatura, siendo la presión de 15 libras por pulgada cuadrada, la requerida para lograr 1210C de temperatura.

Metodología Practica1.3 Esterilización de cultivos

  1. Se coloco un pequeño trozo de cinta indicadora a cada uno de los elementos a esterilizar, con el fin de confirmar al final del ciclo de esterilización, que la temperatura de 1210C fue alcanzada en cada uno de los materiales esterilizados.

  2. Se introdujeron los elementos en el autoclave dejando suficiente espacio entre ellos, para permitir un adecuado contacto con el vapor.

  3. El tiempo de esterilización de los medios de cultivo vienen definidos por el fabricante en la etiqueta correspondiente, generalmente es de 10-15 minutos.

  4. Una vez cumplido el tiempo de esterilización y únicamente cuando el indicador de presión marque cero, podemos abrir el autoclave, dejando la puerta o tapa entreabierta por 15 minutos.

  5. Utilizando alguna protección para el calor, se retiro el medio de cultivo nos permitió que se enfríe ligeramente, al ambiente (No colocarlo en agua o en una superficie muy fría).

  6. Cuando tenga una temperatura cercana a los 500C, lo vertió en las cajas de Petri, esterilizadas previamente en el horno, en una superficie previamente desinfectada y siempre cerca de la llama.

  7. Se marcaron las cajas con las iníciales del medio de cultivo utilizado, en la tapa.

  8. Una vez el medio se encuentre a una temperatura por debajo de 450C, se solidifica y puede ser utilizado.

  9. Si el medio no se ha de utilizar inmediatamente se guardo en forma invertida en la nevera.

  10. Se tomó una caja de cada tipo de medio y se colocó en la incubadora a 30ºC como prueba de esterilidad del medio de cultivo.

  11. Se observó las cajas a las 24 horas. Si el procedimiento ha sido adecuado no debe aparecer ningún tipo de crecimiento en las cajas incubadas.

: agar play count http://www.medica-tec.com/arg/?291,%28bk144ha%29-plate-count-agar-%28p.c.a.%29-500-grs.

Agar saboreaud http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_dextrosa_papa.pdf

Cual es la diferencia entre desinfección y esterilización?

La esterilización es un método del control del crecimiento microbiano que involucra la eliminación de todas las formas de vida, incluidos virus y esporas. Es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad mediante la destrucción de todos los microorganismos contenidos en un objeto, área específica o sustancia, acondicionando de tal modo la posterior propagación o contaminación a otros objetos o al medio ambiente.

Los agentes que matan microbios son denominados microbiocidas (cida= “matar”) o más comúnmente denominados “germicidas”. Si el agente específicamente destruye bacterias, es llamado bacteriocida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea después de exponer el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, éste otra vez se habrá contaminado con microorganismos.

Se trata de un término probabilístico, de modo que tras un adecuado proceso de esterilización, se debe llegar a una probabilidad de encontrar microorganismos igual o menor que una unidad contaminada en un millón de unidades sometidas a un proceso de esterilización.

Los métodos térmicos de esterilización son comúnmente los más utilizados para matar microorganismos, incluyendo las formas más resistentes como lo son las endoesporas.

Se denomina desinfección a un proceso físico o químico que mata o inactiva agentes patógenos tales como bacterias, virus y protozoos impidiendo el crecimiento de microorganismos patógenos en fase vegetativa que se encuentren en objetos inertes.

Los desinfectantes reducen los organismos nocivos a un nivel que no dañan la salud ni la calidad de los bienes perecederos. Algunos, como los compuestos fenólicos, pueden actuar también como antisépticos.

Los desinfectantes se aplican sobre objetos inanimados, como instrumentos y superficies, para tratar y prevenir las infecciones. Entre los desinfectantes químicos del agua más habituales se encuentran el cloro, las cloraminas, el ozono. La desinfección del agua también puede ser física cuando se emplea la ebullición, la filtración y la irradiación ultravioleta. Se deben distinguir los desinfectantes de los sanitizantes que son sustancias que reducen el número de microorganismos a un nivel seguro.

  1. Por qué definimos como medios complejos los utilizados en esta práctica?

Medios complejos

Los medios que contienen algunos ingredientes cuya composición química se desconoce se denominan medios complejos . Estos medios son muy útiles, pues un único medio complejo puede ser suficientemente rico para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos. Además, los medios complejos se necesitan porque a menudo se desconocen los requerimientos nutricionales de un microorganismo en particular, por lo que no se puede elaborar un medio definido. Esto sucede con muchas bacterias exigentes, algunas de ellas son capaces de necesitar un medio que contenga sangre o suero.

Los medios complejos contienen componentes como peptonas, extracto de carne y de levadura. Las peptonas son hidrolizados de proteínas obtenidos de la digestión proteolítica parcial de carne, caseína, harina de soja, gelatina y otras fuentes proteicas. Sirven como fuente de carbono, energía y nitrógeno. Los extractos de carne y de levadura son medios líquidos de carne de vacuno y de levadura de cerveza, respectivamente. El extracto de carne contiene aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales. El extracto de levadura es una fuente excelente de vitaminas del complejo B y de compuestos de nitrógeno y carbono. Tres medios complejos utilizados comúnmente son :

 Caldo nutritivo

 Caldo de soja triptonado

 Agar MacConkey.

Si se necesita un medio sólido para cultivar microorganismos en superficie, se puede solidificar un medio líquido añadiendo agar. El agar es un polímero sulfatado compuesto principalmente por D- galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido-D-glucurónico. El agar es un buen agente solidificador porque, una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40 a 42 oC, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80 a 90 oC. El agar es también un agente endurecedor excelente porque la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo.

A veces se utilizan otros agentes solidificantes. Por ejemplo, se usa gel de sílice para cultivar bacterias autótrofas en medios sólidos en ausencia de sustancias orgánicas, y para definir las fuentes de carbono en bacterias heterótrofas, añadiendo al medio varios compuestos orgánicos.

Los medios de cultivo en microbiología

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariomedios_archivos/image001.gif

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariomedios_archivos/image002.jpg

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

La evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

Tipos básicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado físico:

líquidos

semisólidos

sólidos

atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

Bibliografía

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

http://www.labbox.com/styles/imgs/cart.gif
 

http://www.labbox.com/styles/imgs/top_left.gifhttp://www.labbox.com/styles/imgs/top_right.gif

Cinta indicadora de esterilización


cinta indicadora de esterilización

Cinta autoadhesiva con una tinta especial que cambia de color cuando ha sido expuesta a un ciclo de esterilización
La tinta de la cinta cambia de blanco a marrón cuando ha sido expuesta a 120 ºC durante 20 minutos, a 125 ºC durante 10 minutos o a 135 ºC durante 5 minutos

 http://www.labbox.com/es/productos/F0P00/xP10/STAP/

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