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UNIDAD 5
INSECTOTOXICOLOGÍA
“Si podemos medir una cosa y si podemos expresarla en términos numéricos, comenzamos a saber algo de ella. Pero si no podemos medirla ni hablar de ella en términos numéricos, nuestro conocimiento es de naturaleza vaga e insatisfactoria” (Lord Kelvin)
La experimentación cumple un importante rol en la ciencia ya que permite evaluar los avances tecnológicos. En el campo de la Terapéutica Vegetal, la experimentación nos permite conocer acerca del comportamiento de los nuevos plaguicidas, tanto en lo que respecta a su actividad biocida sobre la plaga a controlar, su acción secundaria sobre el ambiente en el cual se distribuye, parásitoides, predadores, agua, aire y suelo, y también sobre animales de sangre caliente fundamentalmente el hombre.
Experimentación es someter un cuerpo u objeto a ciertos fenómenos para observar su reacción, como vemos el experimentador participa en forma activa en el proceso mediante la elección de un método (proceso sistemático realizado para resolver un problema científico) y pudiendo realizar modificaciones sobre la marcha del experimento. Cuando se realiza un experimento se debe buscar una metodología simple y económica pero a su vez efectiva y repetible de manera de poder comprobar los resultados.
Cuando se realiza investigación en Terapéutica Vegetal para observar la potencia tóxica de los plaguicidas, la metodología empleada será diferente ya sea se trate de un insecticida, funguicida o herbicida.
La experimentación con plaguicidas implica ensayos en laboratorio, invernáculo y a campo. Si bien el fin último de la aplicación de un plaguicida es el campo donde tendremos el conocimiento exacto de diversas propiedades del mismo como ser fitotoxicidad, efectos colaterales, residualidad, lavado, etc., muchos estudios deben ser realizados en el laboratorio debido a que nos permite realizar repeticiones a lo largo del año y por otro lado las pruebas de campo se encuentran con problemas de inconsistencia de las infestaciones, un sin número de variables que sin aislarlas no podríamos individualizar los distintos factores además del elevado costo que estos ensayos presentan, por lo que siempre la investigación a campo es precedida de pruebas de laboratorio e invernáculo y cuando el producto está realmente probado se realiza la fase final de campo que es donde se evaluará la eficacia final del producto.
Insectotoxicología. Esta parte de la ciencia se ocupa de los estudios específicos de la acción tóxica de los insecticidas, tanto en lo que respecta a su modo de acción como a su mecanismo de acción (Toxicocinética y Toxicodinamia). La potencia del tóxico se puede expresar por la dosis letal media (DL50) que es la dosis que mata el 50% de la población en estudio. En estas experimentaciones se trabaja con individuos homogéneos, el mismo número de machos que hembras, que no presenten estrés por lo que nunca hay que trabajar con individuos traídos del campo, deben ser criados en laboratorio y por lo menos trabajar con la F1. Estos estudios se pueden realizar de diferente manera.
Los ensayos de pulverización y de espolvoreo se realizan para observar la eficacia de los plaguicidas en sus distintas formulaciones posibles. Para estos ensayos se puede trabajar en la torre de pulverización basada en la de Waters que consiste en una torre de 92 cm de alto por 22 de diámetro.

Pulverización. El principio activo es diluido en acetona pura y colocado en. En la parte inferior de la torre se coloca una caja de Petri tapada con una malla donde se pone la plaga a tratar. Se realiza vacío de 25 mm de Hg y se deja caer la dispersión líquida dejando actuar durante 15 minutos. Se retira la caja y se realizan observaciones cada 15 minutos durante 24 horas para tener el recuento de individuos afectados.

Espolvoreo. El procedimiento es similar al anterior solamente que el estado físico del disperso en este caso es un polvo.

Para insecticidas gaseosos se coloca la plaga en un ambiente confinado fumigando posteriormente con el gas. Se exponen un tiempo y luego se someten a condiciones estándar y se evalúa.

Como estos métodos no son muy precisos se recurre a las aplicaciones tópicas o inyectables.

Ensayo de topicación. Se hace para productos de contacto y la especia tratada debe tener un tamaño adecuado para la topicación. Lo primero que se hace es anestesiar al insecto utilizando para ello dióxido de carbono. Se comprobó que el mismo es totalmente inocuo para ellos aun a altas dosis. Luego se preparan las diluciones del plaguicida en un solvente no tóxico como la acetona. Los insectos deben ser manipulados con pinzas con lienzo para evitar causarles daño colocándoles el insecticida con una microjeringa manejada con un tornillo micrométrico en un punto sensible (tucuras en el pronoto, cucarachas debajo de las alas, moscas en el tórax) La aplicación se realiza con microjeringas del tipo Hamilton en las cuales c cada presión del pulsador corresponde una carrera del émbolo, entregando cada vez una cantidad medida del plaguicida. Esto se realiza para cada dilución del plaguicida.

Al cabo de un tiempo, que será variable de acuerdo a la especie y al plaguicida de que se trate se procede al recuento de los individuos muertos, considerado muerto aquel individuo que no reacciona al ser tocado con una pinza. Los datos obtenidos se grafican para determinar la DL50.

Debe quedar claro que la DL50 obtenida en laboratorio no representa la que se utilizará en campo, sino que se multiplican entre 400 a 1000 veces para obtener la dosis recomendable a campo.

Administración del tóxico por vía inyectable. Se realiza para plaguicidas liposolubles. Se realiza con una aguja recta, en forma perpendicular en el abdomen entre la primera y segunda membrana abdominal. Una vez obtenida la DL50 se la compara con la obtenida en la aplicación tópica para tener una idea de las barreras que opone el insecto a la penetración. Si las dos DL50 fuesen iguales implicaría la inexistencia de esas barreras, normalmente la dosis tópica es mayor que la inyectada.

Método del film. Se preparan las diluciones del plaguicida en un solvente no tóxico, impregnándose con un volumen conocido de la dilución un papel de superficie conocida (un papel para cada dilución). Se espera que se evapore el solvente y se colocan sobre una superficie de vidrio poniendo sobre cada papel aros de vidrio. En cada aro se introducen los insectos previamente anestesiados con dióxido de carbono y luego se los tapa. Pasadas seis horas los insectos son llevados a otro frasco donde se los mantiene alimentados y a una temperatura de 25ºC. Luego se calcula la mortalidad.

Ensayo de laboratorio con funguicidas. La potencia tóxica del activo se mide en forma análoga a la estudiada en insectotoxicología, con la salvedad que a veces en lugar de utilizar la DL50 se prefiere trabajar con el índice RD50.
a) Método del fenol. Se basa en comparar la acción funguicida del fenol (sustancia patrón) con la del funguicida que se quiere valorar.

Se preparan en tubos de ensayo, series de distintas concentraciones del fenol y del funguicida que se quiere valorar. Se coloca una dilución de esporas y se ve en cada caso cual es el tubo en el que dejan de germinar. Se calcula entonces el coeficiente fenólico, que es el cociente entre la concentración del funguicida sobre la concentración del fenol y su resultado me indica cuantas veces el producto es mas tóxico que el fenol.
b) Técnica del alimento envenenado

Se incorpora el plaguicida al medio de cultivo y se mide el potencial tóxico que inhibe a la colonia. La técnica se basa en el hecho de que el crecimiento de un rango en un medio sólido es lineal con el tiempo, por lo tanto midiendo la diferencia de la colonia tratada con la testigo, es posible construir curvas para diferentes dosis del ingrediente activo en estudio.
c) Germinación de esporas

Se trabaja con esporas que germinan en agua. Se preparan concentraciones conocidas de esporas a las que se añaden diferentes concentraciones del ingrediente activo.

Se colocan las distintas diluciones en cámaras de recuento globular como las F Rosenthal, Thomas o Newbaner, que tienen la forma de portaobjetos excavado presentando en la parte central un micro reticulado; en el caso de la cámara F tiene un cuadrado de 4mm x 4mm dividido en 16 cuadrados cada uno de los cuales se subdivide en 16 cuadrados más chicos (llevar a cámaras a las 24 hs) .

Se lleva al microscopio y se cuenta las esporas que se encuentran dentro de esos cuadrito (se toma 2 líneas perpendiculares y se leen las esporas que tocan esas líneas). Ahora bien, como se conoce la superficie de esos cuadritos y la profundidad de la cámara, se puede referir esos datos a volumen.
N= n x 1000 x D

V
N= Nº de esporas germinadas /cm3

n= Nº de esporas germinadas contadas en la cámara.

V= volumen de cámara donde se determinó n.

D= dilución empleada.

Los valores así obtenidos se clasifican en escalas
d) Respirometria
Se basa en la medida del O2 consumido o del CO2 producidas lo que permite conocer como influye el funguicida sobre el ritmo respiratorio del hongo

Ensayos de laboratorio con herbicidas
Algunos de los parámetros que se pueden evaluar son:

  • Acción tóxica del producto frente al hombre , flores y fauna útil.

  • Propiedades fisiológicas; absorción, tras locación, modo de acción.

  • Lixiviación comportamiento en el suelo

  • Degradación

  • Propiedades físico – químicas (volatilidad: 2,4 – D, Trifluralina) fotolabilidad.

  • Compatibilidad de las mezclas con otros plaguicidas.




  1. Absorción


Para herbicidas de absorción radicular se coloca la planta en un Erlenmeyer con solución nutritiva y se incorpora a la solución la cantidad exacta del herbicida evaluando luego el efecto sobre la planta (peso fresco), para herbicidas de absorción foliar. Se hace una aplicación tópica aislando con un anillo de lanolina y allí se coloca el herbicida.


  1. Translocación


Se trabaja con radioisótopos marcados del herbicida que se incorporan al vegetal y así se ve como la molécula activa se fue trasladando dentro de la planta y porqué vías lo hizo.


  1. Lixiviación


Si bien es un parámetro importante para todos los herbicidas, es especialmente importante en los herbicidas residuales, que se localizan en los primeros centímetros del suelo, y tienen una selectividad agronómica o posicional.

Se trabaja con tubos de PVC o vidrio a los que se les hace una ventana cubierta por acetato.

Se coloca el tubo en forma vertical y se carga con diferentes tipos de suelos, incorporando luego la cantidad medida del herbicida. Luego de un tiempo se coloca horizontalmente y se siembra semillas de un cultivo sensible por ejemplo: pepino a diferentes profundidades. Evaluando el efecto sobre las semillas o plántulas, se conoce la profundidad a la cual se lixivia.


  1. Degradación


Su estudio sirve para tener una idea de la residualidad del producto. Se preparan lotes de plantas en terrinas o macetas a las que se incorpora el plaguicida y se va evaluando al peso fresco y peso seco a intervalos de tiempo regulares.
Ensayos con herbicidas en invernáculos
Se llevan a cabo para determinar:

  1. Efecto del herbicida sobre las malezas.

  2. Efecto del herbicida sobre el cultivo.

  3. Malezas resistentes al herbicida.


Ensayos de campo
Hemos dicha ya que los ensayos de campo representan un paso fundamental en el desarrollo de un plaguicida ya que permite corroborar los resultados obtenidos en laboratorio como así también obtener información adicional de cómo se comportara el producto al ser aplicado en el medio para el cual fue creado.

En la realización de un ensayo a campo intervienen varios pasos en cada uno de los cuales se debe trabajar con la mayor precisión posible:

  1. Planificación

En primer lugar se debe definir el objetivo del ensayo.

  1. Objetivo (plaga, cultivo, un nuevo producto, etc.).

  2. Diseño experimental. De acuerdo a la heterogeneidad del terreno

  1. Tamaño de parcelas: es muy variable, dependiendo del objeto del ensayo; por ejemplo si es una plaga móvil el tamaño será mayor que para una plaga fija. En ensayos de herbicidas las parcelas deben ser lo más pequeñas posible, siempre que proporcionen la información deseada con poca variación.

Se consideran factores como ser:
Objetivos: ensayos de selección
Uniformidad de malezas: a mayor uniformidad menor tamaño.

Tipo de malezas: rastreras, perennes y anuales.

Tipo de cultivo: Por ejemplo caña: 2 surcos x 8m, soja: 5lineas x 5m.

Equipo: equipos manuales para parcelas de menor tamaño.

Prácticas culturales: distancia entre filas, sistemas de riego.


  1. Forma de la parcela (por efecto vecinal convendría hacerlas cuadradas para asegurarnos un núcleo para la evaluación).

  2. Borduras: es fundamental dejar borduras que constituyen la transición entre dos tratamientos diferentes. El espacio que se deja será también muy variable de acuerdo al ensayo. Por ejemplo: para herbicidas en cultivo de línea por lo menos 3 o 4 hileras.

  3. Numero de tratamientos y números de aplicaciones según el plaguicida.

  4. Testigos: absoluto

mecánico (herbicidas)

químico (tratando con el mejor activo conocido para ese objetivo o el producto más usado etc.)

  1. Número de repeticiones: también es variable pero en general nunca deben ser repetidos menos de 3 o 4 campañas.

  1. Elección de plaguicida: Compuesto: producto nuevo o existente para otros usos.

Formulación

  1. Dosificación (dosis, volumen de aplicación, concentración) a veces viene propuesto.

  2. Equipos dispersores (espolvoreadoras, pulverizadores, atomizadores, etc.).

En lo que se refiere a pulverizaciones que es el medio de dispersión más común en los ensayos, se utilizan equipos de alta precisión denominados equipos experimentales que permitan un control preciso de la dosis a aplicar, presión de trabajo y caudales dispersados. Entre ellos tenemos:

  • Pulverizador Wilcox.

  • Campana pulverizadora.

  • Pulverizador Oxford.

  • Pulverizador logarítmico.

  • Pulverizador de fases.

  • Micropulverizador.




  1. Ejecución




  1. Ubicación, fecha, condiciones:(lugar, fecha, hora, características del suelo, condición ambiental, estado del cultivo).

  2. Evaluación del grado de infestación (métodos emplear, expresión de la infestación).

  3. Calibrado del equipo dispersor, (gasto por minuto de las boquillas, velocidad y presión de trabajo, ancho de labor).

  4. Aplicación: (gasto o cantidad a aplicar por parcela, ajuste de dosis, momento de aplicación).




  1. Evaluación de los resultados




  1. Recuento y apreciación de los daños (sistemas empleados, usos de escalas.

  2. Condiciones ambientales durante el ensayo.

  3. Efectos secundarios (fitotoxicidad, acción secundaria sobre otras especies).




  1. Expresión de los resultados (aplicación de fórmulas para expresar grados de control).




  1. Verificación de la exactitud de los resultados. Aplicación del cálculo estadístico: (Prueba de significación, Tuckey).


Evaluación de los resultados

Entre los métodos mas usados para obtener los resultados son:

  • Determinación por conteo

  • Determinación por medición

  • Determinación por estimación

Otro criterio importante a considerar es la escala de medición que se usará para captar los datos. Básicamente tenemos cinco tipos de escala, las tres primeras son escalas cualitativas y las dos últimas son escalas cuantitativas.
Escala nominal. Está compuesta de un conjunto de alternativas cambiables que están definidas mediante una descripción. Ej.: tipo de malezas en un ensayo, sorgo o Amaranthus, una decisión binaria (si no), vivo o muerte, macho o hembra, con ataque o sin ataque.

Escala de rangos. Se ordenan los objetos en rangos que forman una sucesión en serie, por ejemplo según tamaño, intensidad de color, intensidad de grado de ataque.

Escala ordinal: es la más utilizada en la experimentación agrícola, los objetos son clasificados en determinadas clases previamente fijadas, en general el nº de clases es menor de diez.

Escala de intervalos: está constituidas por unidades constantes, sin embargo las unidades de medición y el punto cero son arbitrarios, o sea que al desplazarlo no se modifican los resultados.

Escala absoluta: está constituida por intervalos constantes y provistos de un cero absoluto, por ejemplo altura del cultivo, rendimiento, medición de residuos, etc.

Ahora vamos a ver distintos métodos utilizados para evaluar los ensayos con insecticidas, con fungicidas, y con herbicidas.
Valoración de insecticidas
Métodos de valoración en control de parásitos de origen animal
El valor de un plaguicida se expresa generalmente por el grado de aplicación, que indica el porcentaje en que ese producto puede reducir la intensidad de ataque o el grado de daño.

Para el cálculo de la eficacia existen diferentes formulas:
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