Resumen la presencia de material lignocelulósico y coloración ligada a éste, en aguas residuales de la industria papelera es un problema ambiental y sanitario,




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ANEXO D

(Artículo para revisión Revista Colombiana de Biotecnología)

Disminución de fenoles, DQO, DBO5 y color en licor negro por el hongo Pleurotus ostreatus
Decreased phenols, COD, BOD5 and color in black liquor by the fungus Pleurotus ostreatus
Iván Felipe Vidal Martínez*, Ricardo Benítez Benítez**, Clara Inés Giraldo***

RESUMEN

La presencia de material lignocelulósico y coloración ligada a éste, en aguas residuales de la industria papelera es un problema ambiental y sanitario, porque muchos de estos compuestos pueden ser tóxicos y/o cancerígenos para las poblaciones biológicas que hacen uso de los ríos en los que se desechan estas aguas. La biorremediación es una alternativa para la remoción de este tipo de material. En el presente trabajo se evaluó la capacidad de una cepa no identifica del hongo ligninolítico Pleurotus ostreatus de degradar lignina (material lignocelulósico) contenida en licor negro proveniente del pulpeo de bagazo de caña. La cepa fue incubada en medio líquido e inmovilizada en malla de polietileno sin agitación. Se midieron los parámetros fisicoquímicos fenoles totales (en extracto de lignina), DQO, DBO5, color American Public Health Association (APHA) y color National Council for Air and Stream Improvement (NCASI) durante 21 días cada 3 días. Se encontró que la cepa P. ostreatus sp., fue capaz de reducir el valor de los parámetros analizados en 56,3% para los fenoles totales, 80,0% de la DQO, 39,4% de la DBO5, 53,9% de unidades de color APHA y 58,4% de unidades de color NCASI en licor negro diluido al 2% a través de los 21 días. Esta disminución es coherente con una deslignificación llevada a cabo muy posiblemente por las enzimas ligninolíticas de la cepa P. ostreatus, y permite calificar a la especie P. ostreatus como un BUEN degradador de material lignocelulósico del licor negro diluido, aún sin una adaptación prolongada.
Palabras clave: Lignina, enzimas ligninolíticas, pudrición blanca, inmovilización fúngica.

ABSTRACT

The presence of lignocellulosic material and color linked to it, in waste water of the paper industry is an environmental and health problem because many of these compounds may be toxic and/or carcinogenic to biological populations who use the rivers in which these waters are discarded. Bioremediation is an alternative for the removal of such material. In this study we evaluated the ability of a strain does not identify the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus to degrade lignin (lignocellulosic material) contained in black liquor from the pulping of bagasse. The strain was incubated in liquid medium and immobilized in polyethylene mesh without agitation. Physicochemical parameters were measured total phenols (lignin extract), COD, BOD5, color APHA and color NCASI by 21 days every 3 days. It was found that the strain P. ostreatus sp., was able to reduce the value of the parameters analyzed in 56.3 % for total phenols, 80.0 % of COD, BOD5 39.4%, 53.9% APHA color units and 58.4 % of NCASI color units in black liquor diluted to 2% over the 21 days. This decrease is consistent with a delignification performed quite possibly by ligninolytic enzymes of the strain P. ostreatus, and able to qualify the species P. ostreatus as NICE degrading lignocellulosic material diluted black liquor, even without prolonged adaptation.
Key words: Lignin, ligninolytic enzymes, white rot, fungal immobilization.

INTRODUCCIÓN
En pos de convertir los procesos productivos en procesos limpios y eficientes energéticamente, el uso de la biotecnología desempeña un papel crucial en esta transformación tecnológica. La aplicación de microorganismos para la prevención, control y remediación de la contaminación se presenta como una alternativa para reducir o eliminar el impacto ambiental generado por ésta (Dávila y Vásquez, 2006). Entre estas alternativas se encuentran el uso de hongos de pudrición blanca ya que pueden usar sistemas enzimáticos para la transformación de contaminantes y compuestos xenobióticos (Ali y Sreekrishnan, 2001). Esta capacidad surge de la necesidad de alimentarse con celulosa y hemicelulosa, pero a partir sustratos lignocelulósicos, en los cuales estos compuestos se encuentran fuertemente enlazados con lignina (Lange et al. 2013).
La lignina es un heteropolímero muy recalcitrante que conserva parte de su estructura aún después de ser sometido a digestión para liberar la celulosa, tal como sucede en las industrias de pulpa y papel. Estas industrias producen grandes cantidades de efluentes de desecho con un alto y variado contenido de compuestos tóxicos (Pérez et al. 2002).
La carga orgánica y el color de estos efluentes se debe principalmente a la lignina, a los derivados de lignina y a taninos polimerizados, que son en su mayoría descargados del pulpeo, blanqueo y las secciones de recuperación, por lo tanto, los efluentes de estas etapas están muy coloreados y aportan el 80% de color, el 30% de la DBO y el 60% de DQO a la carga total de contaminación de la planta (Lara et al. 2003).
La capacidad de transformación de contaminantes y xenobióticos de los hongos de pudrición blanca, en especial su capacidad ligninolítica debida a la actividad oxidativa y la baja especificidad de sustrato de las enzimas ligninolíticas (Lignino Peroxidasa, LiP; Manganeso Peroxidasa, MnP; y Lacasa, Lac), los hace ideales para su uso como biorremediadores de éste tipo de situaciones. Es por esta razón que en este trabajo de investigación se utilizó el hongo ligninolítico Pleurotus ostreatus para degradar la lignina contenida en el licor negro proveniente de la fabricación de pulpa de papel a partir de bagazo de caña, a través una biopelícula formada con el hongo inmovilizado. Asimismo se determinó la concentración de fenoles totales (grupo representativo de la lignina) y algunas características fisicoquímicas (DBO, DQO, color) del licor negro antes, durante y después de la experiencia.
Mediante esta experiencia se espera aportar información sobre la capacidad degradadora (de una especie de hongo muy utilizada) de lignina y el cambio de algunos parámetros fisicoquímicos hídricos en un sustrato prácticamente desconocido.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención del microorganismo. En este estudio se utilizó una cepa de Pleurotus ostreatus sin identificar donada por el cepario del Centro Nacional de Investigaciones del Café (CENICAFE). Chinchiná, Caldas, activada y conservada según especificaciones del proveedor.
Obtención del efluente. La muestra que se utilizó en este estudio se recolectó del canal que transporta el licor negro desde el digestor hacia la torre de recuperación de la empresa Carvajal Pulpa y Papel® (antes PROPAL S.A.), Colombia. A la muestra se le retiraron los sólidos suspendidos de mayor tamaño. La muestra fue tomada por la empresa, y almacenada en refrigeración en un recipiente de plástico.
Activación y replicación del hongo. La cepa fue sembrada en medio sólido de Agar Extracto de Malta (EMA) el cual contiene Extracto de Malta 12,75 g/L; Dextrina 2,75 g/L; Glicerina 2,35 g/L; Peptona de Gelatina 0,78 g/L; Agar 15,0 g/L. La incubación se realizó a 28 °C por 10 días.
Medio de cultivo de pre-adaptación. El hongo fue sembrado en medio de cultivo sólido EMA que además contenía licor negro diluido al 2% suplementado con 0,0113 g/L de CuSO4; 0,1 g/L de ZnSO4·7H2O; 0,1 g/L FeSO4·7H2O, 0,5 g/L MnSO4·H2O; 0,5 g/L MgSO4·7H2O; 1 g/L KH2PO4 y 0,1 g/L CaCl2·2H2O para la activación de enzimas ligninolíticas (Fernández et al. 2009). Además fue suplementado con Glucosa como fuente de Carbono (co-sustrato) 1 g/L, y Tartrato de Amonio 0,2 g/L como fuente de Nitrógeno (Wu et al. 2005).
Biorreactores a microescala, inmovilización y condiciones de cultivo. Se realizó un montaje de biorreactores a microescala por triplicado en el cual se sembró al hongo en un medio líquido, en éste se utilizaron 150 mL de licor negro diluido al 2% y suplementado como en la pre-adaptación, pero con 3,2 g/L de Extracto de Malta; 0,7 g/L de Dextrina; 0,6 g/L de Glicerina; y 0,195 g/L de Peptona de Gelatina (un cuarto de los componentes del agar EMA, debido a que el hongo presentó crecimiento con estas cantidades en ensayos preliminares, no mostrado). El licor suplementado fue dispuesto en frascos de 250 mL junto con una malla de polietileno (soporte de inmovilización de 50 de largo por 5 de ancho), dispuesta en forma enrrollada. El conjunto fue esterilizado antes de la siembra, luego inoculado con 5 discos de agar de 1 cm de diámetro que contenía el hongo P. ostreatus sp., crecido (10 días de incubación). Los discos fueron dispuestos aleatoriamente entre las paredes de la malla. Todos los frascos fueron tapados con tapones de algodón y gasa, y recubiertos con cinta vinipel para evitar contaminación cruzada y permitir el paso de oxígeno hacia el interior del biorreactor. Los montajes finalmente fueron incubados a 28 °C por 21 días sin agitación. Se preparó un control con idénticas condiciones a las repeticiones, pero sin hongo. Además se realizó el seguimiento del cambio de los parámetros fisicoquímicos (fenoles totales, DQO, DBO5 y color) durante el transcurso del bioensayo realizando muestreo en cámara de flujo laminar cada 3 días, las muestras fueron centrifugadas (3000 r.p.m.) y filtradas cuando se requirió.
Determinación de la concentración de fenoles totales en el licor negro. Mediante este ensayo se determinó el cambio en la concentración de los fenoles totales en la lignina extraída de las muestras de licor negro diluido sometidas a deslignificación por efecto del hongo P. ostreatus. Como es sabido la composición química del licor negro se puede considerar como una solución acuosa compleja, que comprende materiales orgánicos (lignina, polisacáridos y compuestos resinosos de baja masa molecular) y compuestos inorgánicos (principalmente iones de sales solubles) (Cardoso et al. 2009). La lignina a su vez al ser una molécula muy compleja, compuesta en gran medida por grupos hidroxilo fenólicos (1,5 a 5,1% para bagazo de caña dependiendo del solvente de extracción según Mousavioun y Doherty, 2010), que toman parte o se forman en diversas rutas metabólicas en la biodegradación, son por tanto indicadores de un cambio en la estructura de la lignina.
Precipitación de lignina. Se filtró la muestra para retirar impurezas y materiales fibrosos. Seguidamente se calentó a 50 ºC en agitación constante; con gotero se agregaron pequeñas cantidades de ácido sulfúrico (H2SO4) 1N hasta alcanzar un pH igual a 2. La suspensión obtenida al precipitar la lignina se llevó a centrifugación a 2500 rpm por 20 minutos con la finalidad de separar el precipitado. Esta precipitación se entremezcló con filtración y sucesivos lavados del residuo obtenido con una solución de NaOH 1N, agua desionizada (para reducir el contenido de Azufre) y hexano (para eliminar los compuestos orgánicos de bajo peso molecular). Dado que la purificación se llevó a cabo mediante la extracción con hexano, se secó la lignina antes y después de la extracción con el mismo. Finalmente, el precipitado se llevó a la estufa a 50 ºC, por 24 horas (Cardozo et al. 2009).
Extracción con solventes. En Beacker de 100mL se le añadieron 25mL de agua a la muestra de lignina seca. Se sometió a agitación durante algunos minutos. Luego se decantó, y el sobrenadante y se almacenó; al residuo sólido se le añadió el mismo solvente y se repitió todo el procedimiento anterior hasta alcanzar un sobrenadante incoloro. Al obtener todo el sobrenadante, éste se llevó a la estufa a 50 °C por 24 horas. De esta forma, se eliminó el agua, y se obtuvo la fracción de lignina extraída. Para aumentar la solubilidad de la fracción, la muestra se sometió a ultrasonido durante 30 segundos (Gonzales et al. 2007).
Análisis de las fracciones. Las muestras se solubilizaron en hidróxido de sodio 0,01N. A 500 μL de muestra, se adicionaron 2,5 mL de reactivo de Folin diluido 1/10. La mezcla se agitó por 3 minutos y luego se añadieron 2 mL de Na2CO3 al 7,5 %. La intensidad del color desarrollada a las 2 horas se medió a 760 nm ante un blanco preparado de la misma manera con agua. La concentración de fenoles fue determinada a partir de una curva de calibración preparada por triplicado, usando fenol como estándar (Gonzales et al. 2007). La solución stock de Fenol fue preparada y/o estandarizada siguiendo las recomendaciones del Método Estándar (APHA, 1992) para determinación de fenoles 5530 C.
Determinación Demanda Química de Oxígeno, DQO 5220 D. Se realizó este ensayo con el fin de observar el cambio de la materia orgánica (químicamente oxidable) presente en el licor negro como respuesta al proceso de biodegradación generado por el hongo P. ostreatus. La metodología utilizada fue la de DQO de reflujo cerrado, método colorimétrico 5220 D del Método Estándar (APHA, 1992).
Determinación Demanda Bioquímica de Oxígeno, DBO5. El objetivo de esta determinación fue la de corroborar junto con la DQO un cambio en la materia orgánica presente en el licor negro como respuesta al proceso de biodegradación generado por el hongo P. ostreatus. Para esta prueba se siguió la metodología de determinación respirométrica en biómetros Oxitop, de la DBO5 en aguas residuales contaminadas con productos orgánicos, toxinas o inhibidores inorgánicos (Slevogt, 2010) basada en el Método Estándar en su metodología 5210.
Determinación del color verdadero por los métodos estándar APHA de Platino-Cobalto y NCASI (medición de color en las aguas residuales de plantas de celulosa). La prueba de color fue realizada con el fin de observar el cambio de este parámetro con respecto al tiempo como respuesta al proceso de biodegradación generado por el hongo P. ostreatus. Se siguió la metodología descrita para la determinación del color, verdadero, aparente y NCASI descrita en el Método estándar APHA 2120 de platino-cobalto para agua, aguas residuales y agua de mar. Equivalente al método NCASI 253 y NCASI Método Color de 71.01 (NCASI, 2000) para pulpa y el papel de efluentes utilizando 465 nm (requiere ajuste de pH).
Análisis de la información. Se evaluaron para los datos obtenidos el tipo de distribución, homogeneidad de varianzas, efectos principales e interacciones de las variables mediante pruebas paramétricas o no paramétricas cuando fue el caso. Además para todos los casos que requirieron curvas de calibración se realizó el análisis mediante estadística de regresión. Además se realizó una prueba de correlación simple de Pearson con el objetivo de verificar si existe independencia o no entre los parámetros determinados. El manejo estadístico integral de la información se realizó mediante el paquete estadístico SPSS Statistics® versión 11.5.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de la concentración de fenoles totales. En la figura 1 se observa la tendencia de la concentración de fenoles totales (en extractos de lignina) en el control y en las repeticiones durante el transcurso del ensayo final, en este puede notarse una disminución de la concentración de fenoles totales en los 21 días.


Figura 1. Tendencia de la concentración de fenoles totales en el transcurso de los 21 días.
Esta tendencia puede explicarse en parte gracias a la actividad de las enzimas ligninolíticas tales como: Manganeso Peroxidasa (MnP), Versátil Peroxidasa (VP) y Lacasas (Lac), debido a que en primera instancia complejos quelatos de Mn (III) actúan como oxidantes difusibles de sustratos fenólicos que involucran la oxidación por 1e- del sustrato para producir un radical fenoxílo intermediario, el cual se somete a reordenamientos, divisiones de enlaces, y la degradación no enzimática para producir diversos productos de degradación (figura 2). El Mn (III) generado por la MnP puede catalizar la oxidación de fenoles simples, aminas, colorantes, así como subestructuras fenólicas de lignina y dímeros. Por su parte la VP al combinar los ciclos catalíticos de Lignino peroxidasa (LiP) y MnP produce en últimas, mecanismos de oxidación de sustratos fenólicos similares (Wong, 2009; Hofrichter, 2002). Finalmente en subestructuras fenólicas de lignina, las lacasas catalizan la sustracción de 1e- de los grupos hidroxil fenólicos para formar nuevamente radicales fenoxílo, esta reacción conduce a rompimientos Cα – Cβ, oxidación del Cα (figura 2, estructura 9), rompimiento aril-alquil (figura 2, estructuras 4 y 6) y rompimiento de anillos aromáticos, también viene acompañada por desmetilación, y formación de quinonas Wong, 2009; Hofrichter, 2002; Martínez, A., et al, 2005).

Resultados similares a los observados en este estudio fueron encontrados por Fountoulakis et al. 2002 y Aggelis et al. 2003, quienes obtuvieron una reducción de hasta 78,3% y 80% respectivamente de fenoles totales en aguas residuales de molienda de oliva utilizando P. ostreatus. La cinética de la concentración de fenoles totales mostrada en este estudio arrojó en promedio una disminución del 78,3% de este parámetro con respecto al control (figura 10), mientras que con respecto al licor negro diluido al 2% fue del 56,3%. Además la tendencia muestra para los días 3 y 12 un aumento no significativo de la concentración de fenoles totales, sugiriendo un aumento de la actividad ligninolítica previa a la fase de oxidación de los nuevos fenoles formados, también se infiere que el proceso de reducción de fenoles totales pudo ocurrir en 2 ciclos: (i) el aprovechamiento por parte del hongo de compuestos que le sirvan de alimento tales como: celulosa, xilános, hemicelulosa, glucosa, tartrato de amonio, etc., para el crecimiento y establecimiento de la comunidad (Wu et al. 2005; Martínez, M., et al. 2005) y (ii) una verdadera deslignificación a partir del día 9, en la que el hongo ya establecido y con poca alimentación hace un mayor uso de sus enzimas para degradar la lignina y asimilar compuestos enlazados a esta o de metabolitos generados a partir de esta (Martínez, A., et al, 2005).
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