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4. METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO:
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN:

(En el caso de proyectos coordinados deberá abarcar a todos los subproyectos)

Especificar claramente cómo se pretende alcanzar los objetivos del proyecto.



OBJETIVO 1.- Estudiar la respuesta agronómica de las especies espliego (Lavandula latifolia (L. Fil.) Medikus), romero (Rosmarinus officinalis L.) y salvia (Salvia lavandulifolia Vahl) sometidas a diferentes factores de manejo durante los años 4 y 5 del ciclo productivo para poder obtener una serie de datos, como mínimo de la mitad o 2/3 partes de su ciclo productivo completo.
Para conseguir el primer objetivo se continuará con los ensayos agronómicos iniciados en el año 2006, puesto que son especies plurianuales y con un ciclo productivo de 6-8 años como mínimo, de los cuales actualmente solo disponemos de los resultados de tres años.
Ensayo 1: Disponibilidad de agua y densidad de plantación: diseño experimental split-plot con tres repeticiones, siendo el factor principal el riego y el factor secundario la densidad de plantación:

Factores de ensayo:

  • Disponibilidad de agua con 3 niveles: testigo, 30% Eto, 80% Eto.

  • Densidad de planta con 2 niveles: baja con 22.000 pl/ha (1,2 x 0,6) y alta con 33.000 pl/ha (0,8 x 0,6).

Variables analizadas:

  • Biomasa fresca en estado de máxima floración. (Rendimiento en planta fresca)

  • Humedad del material vegetal. (Rendimiento en planta seca).

  • Relación hoja/planta

  • Riqueza en aceite esencial

  • Composición del aceite esencial

En este ensayo participaran los subproyectos de: Cataluña (para el ensayo de campo) e INIA (para todo el análisis químico).
Ensayo 2: Control de malas hierbas en secano. Estudio de las comunidades vegetales. Control de flora arvense por las cubiertas

Diseño experimental split-plot con tres repeticiones, siendo el factor principal la cubierta y el factor secundario el momento de recolección:

Factores de ensayo:

  • Cubierta de la calle con 4 niveles: paja de cereal, restos de destilería picados, cubierta vegetal viva con leguminosa y testigo sin cubierta.

  • Momento de recolección con 2 niveles: vegetativo y floración

Variables analizadas:

  • Se hará la identificación botánica de todas las especies que aparezcan en los distintos tratamientos.

  • Se cuantificarán los niveles de infestación utilizando la técnica experimental descrita por García Torres y Fernández Quintanilla (1991) denominada “muestreo de poblaciones naturales”. Se realizarán 3 muestreos al azar de 0,25m2 en cada parcela, al final del invierno y en el mes de mayo.

En este ensayo participaran el subproyecto de Castilla-La Mancha – INIA.

OBJETIVO 2.- Completar la prospección y recolección de material vegetal de poblaciones de espliego, romero y salvia y en diferentes regiones del territorio nacional
Se realizará una prospección de la flora silvestre de Rosmarinus officinalis L., Salvia lavandulifolia Vahl. y Lavandula latifolia (L. Fil.) Medicus, en algunas zonas de distribución no colectadas y en especial salvia y espliego en Castilla y León. Se tomará una muestra individual de 500gr de hojas y sumidades floridas, de al menos 50 plantas tomadas al azar que representen al conjunto de la población en la época de floración, al coincidir según la bibliografía consultada, el momento de máximo rendimiento en antioxidantes con el de los aceites esenciales de acuerdo a los estudios previos realizados (Sotomayor, 1998). Este material se secará a temperatura ambiente en lugar seco y a la sombra hasta su estabilización y se conservaran guardadas en bolsas de papel o tela perfectamente identificadas hasta su análisis en el laboratorio del INIA de Madrid. En el momento de la recolección se tomaran los datos de pasaporte, lo mas completos posible.

Para la recolección de muestras de semilla de las poblaciones seleccionadas, se recogerán semillas maduras en toda la población, de forma suficiente y correcta (no destruir la población). Los materiales a utilizar en la colecta serán sobres de papel para guardar las semillas o sacos de tela donde guardar las infrutescencias y tijeras podadoras de pequeño calibre. El transporte y almacenamiento de las semillas hasta la base se hará lo antes posible y manteniendo la unidad de almacenamiento para cada lugar de recolección. Una parte de la semilla colectada se utilizará en los ensayos y el resto se enviará para su conservación a bancos de semillas nacionales.

OBJETIVO 3.- Iniciar los trabajos de selección y mejora de las poblaciones silvestres de espliego, romero, salvia y mejorana (Thymus mastichina L.) en base a sus características morfológicas y químicas analizadas en su mayoría en el proyecto anterior.
Partiendo de las poblaciones prospectadas de las cuatro especies de estudio (salvia, romero, espliego y mejorana) que ya fueron caracterizadas químicamente, se seleccionarán en torno a 12 poblaciones a partir de los resultados analíticos obtenidos en proyectos anteriores, de acuerdo con el rendimiento y calidad de los aceites esenciales y de su riqueza en principios activos no volátiles (compuestos antioxidantes). De cada población se recogerán esquejes de los individuos con mejores características morfológicas y se procederá a su enraizamiento. Con los esquejes enraizados se establecerán ensayos en ambientes diferentes.

Se pondrán dos ensayos por especie, de salvia serán realizados por el CIA y el ITACyL; de romero serán controlados por CIA y CTFT; de espliego plantados por INIA y CIA y de mejorana que será realizado por el ITACyL e INIA.

El diseño de los ensayos será de bloques completos al azar con tres repeticiones, en parcelas de 5.00x1.00m, con 25 plantas, que estarán en cultivo durante al menos 4 años. De cada parcela se recogerá una muestra de hojas y sumidades floridas en el momento de plena floración para estudiar:

  • Rendimiento de biomasa expresado como peso seco.

  • Rendimiento en aceite esencial.

  • Composición de volátiles del aceite esencial.

anotándose durante las campañas productivas en el periodo de experimentación:

  • Datos climáticos: temperatura y pluviometría.

  • Calendario de los diferentes estados fenológicos.

  • Altura y diámetro de planta (10 plantas/parcela).

  • Seguimiento de plagas y enfermedades.

  • Fecha de recolección.

  • Contenido de humedad de la planta en el momento de recolección.

Todos los ensayos se realizarán en la modalidad de agricultura ecológica.

El primer año se plantarán los ensayos de mejorana y romero. El segundo año se plantarán los ensayos de salvia y espliego, para poder terminar la prospección de estas especies que se refleja en el objetivo 2. A partir del segundo año de cultivo, podrán comenzar a realizarse los primeros análisis químicos que nos permitan iniciar nuestro programa de selección de poblaciones. Dado que sería conveniente el seguimiento químico de las poblaciones durante 4 campañas, la selección de las poblaciones sólo podrá realizarse fuera de la duración de la presente propuesta. El objetivo final de estos ensayos es seleccionar la/s población/es que presenten mejores características desde el punto de vista agronómico y de su composición química. Posteriormente, y dentro de las poblaciones seleccionadas podrá realizarse una selección de individuos con buenas características morfológicas: porte, desarrollo vegetativo, número de flores, etc. y eventualmente por la composición de su aceite esencial, que podrán reproducirse clonalmente y/o establecer huertos semilleros para una producción de semilla, frecuente, abundante y de fácil recogida (Pardos, 1988). De esta manera podrá seleccionarse material homogéneo y de calidad para entregar a los viveros interesados y así realizar plantaciones comerciales con un material vegetal autóctono seleccionado. Este objetivo se conseguirá a medio plazo fuera del ámbito de este proyecto.

En los ensayos de espliego, romero y salvia se plantarán dos testigos con los que poder comparar las poblaciones en proceso de selección y mejora. En base a una preselección, según las características morfológicas de la planta, realizada en la parcela de Solsona durante los años 2006-2008, se escogerán las plantas testigo. Este material se multiplicará en las instalaciones del IRTA siguiendo los resultados obtenidos en los proyectos anteriores.

En los ensayos de mejorana, se plantarán 8 poblaciones seleccionadas de la prospección realizada en Castilla y León en proyectos anteriores. Se utilizarán como testigos cuatro quimiotipos (cineol, linalol, carvacrol y geraniol) de Castilla-La Mancha, identificados también en proyectos anteriores, sobre la base de su composición química y rendimiento en aceites esenciales.

Los análisis químicos de los ensayos de romero y espliego serán realizados por el laboratorio del grupo del INIA, y los análisis químicos de los ensayos de salvia y mejorana serán realizados por el laboratorio del grupo del ITACyL.

Los análisis químicos se realizarán siguiendo la metodología general que se expone:

  1. Secado: las muestras se mantendrán en estufa a 35ºC hasta peso constante.

  2. Determinación de humedad: Se determinará por arrastre con un disolvente no miscible con agua, como xileno o tolueno.

  3. Obtención y análisis de los aceites esenciales: destilación de las partes aéreas recolectadas y deshidratadas previamente, siguiendo la metodología propuesta por la Farmacopea Europea para la determinación del rendimiento en aceite esencial mediante hidrodestilación en Clevenger, durante 2 horas. El aceite obtenido, previa desecación con sulfato sódico anhidro, se recogerá en viales ámbar, para evitar que se altere su composición por efecto de la luz y se mantendrán a 4ºC hasta su análisis cromatográfico. Los aceites se analizarán por Cromatografía de Gas-Líquido, en Cromatógrafo de gases, con detector FIT y columna capilar de 30m, de 5% fenil metil, silicona. Se aplicará gradiente de temperatura de 70 a 240ºC, con un incremento de 3º por minuto, manteniendo la temperatura final durante 2 minutos. Para la identificación de los componentes de los aceites esenciales, se utilizarán los tiempos de retención relativos de sustancias puras y los correspondientes índices de Kovats. La cuantificación de los componentes, se hará de acuerdo con las áreas de sus picos cromatográficos.

  4. Obtención y análisis de componentes no volátiles (ácidos fenólicos, flavonoides, etc): los residuos de la destilación de cada una de las muestras, se secarán en estufa a 35ºC hasta peso constante. El residuo seco y pulverizado en molino de aspas tipo Culati, con malla de 5m se conservará libre de humedad hasta proceder a su extracción. Una cantidad de muestra, previamente desecada y desengrasada, se someterá a extracción metanólica, en soxlhet. Los extractos metanólicos obtenidos, se analizarán por cromatografía de líquido-líquido, con columna C18 de fase reversa y aplicando gradiente, comenzando con 10% de metanol y 90% de agua y finalizando con 95% de metanol y 5% de agua en 50 minutos. La identificación se lleva a cabo comparando los espectros de los componentes de los extractos con los de sustancias puras, mediante un detector de Dyodo-Array. La cuantificación se realiza por el método del patrón externo.

  5. Análisis de resultados y selección de quimiotipos: los resultados de los análisis químicos se someterán a un tratamiento estadístico, tanto del rendimiento en aceite, como de su composición y el contenido en antioxidantes. Se seleccionarán las procedencias, en las que la composición de su aceite esencial cumpla las Normas ISO (Internacional Standard) y de ellas, aquellas con mejor rendimiento en aceite esencial, así como las que a pesar de no cumplir las Normas tengan rendimiento en aceite esencial o alguno de sus componentes destacables. Se elegirán así mismo poblaciones con mayor contenido en principios activos no volátiles (ácidos fenólicos y flavonoides) y aquellas en las que destaque alguno de sus componentes.



OBJETIVO 4.- Elaboración de mapas de distribución silvestre de los quimiotipos de las especies silvestres estudiadas según su riqueza en principios activos utilizando como herramienta el análisis mediante sistemas de información geográfica.
Se vaciaran los pasaportes de las diferentes poblaciones de las tres especies recogidas durante los años 2006, 2007 y 2008, creándose una base de datos con todas las poblaciones, con una tabla con los campos del pasaporte y otra con la composición química de las diferentes poblaciones.

Mediante el análisis con Sistemas de Información Geográfica (SIG) y utilizando las capas relativas a los parámetros físicos, geográficos, climáticos y edáficos que se estiman importantes de antemano, en relación a la distribución de los quimiotipos de las poblaciones estudiadas, se buscarán las relaciones entre la distribución de los distintos parámetros implicados y la existencia de un quimiotipo específico en una zona determinada del territorio. Este análisis se llevará a cabo partiendo del siguiente material cartográfico acompañado de la fuente de donde debe provenir la información:

  • MDT o curvas de nivel, a una escala adecuada de las zonas de estudio. Esta información permitirá derivar a las capas de pendientes y orientaciones a utilizar en este proyecto. Estos datos son propiedad de los departamentos responsables de mantener la información cartográfica en cada uno de los gobiernos autonómicos.

  • Mapa de suelos, a escala 1:100.000, realizado por el Ministerio de Medio Ambiente, de donde se obtiene la información de los tipos de suelo.

  • Inventario Forestal Nacional 3: El IFN3, realizado por el Ministerio de Medio Ambiente, contiene una base de datos de parcelas forestales recogidas de manera regular en una malla de 1 Km x 1 Km. Cada una de estas parcelas lleva asociado su valor de pH correspondiente. A partir de estos datos y mediante la interpolación utilizando métodos geoestadísticos, se puede conseguir un mapa de pH de los suelos españoles.

  • Atlas Climático Digital de la Península Ibérica, realizado por la Universitat Autònoma de Barcelona, de donde se obtendrán los datos relativos a las condiciones climáticas de las zonas de estudio, y que está disponible a través de Internet.

Una vez obtenidos los datos en formato digital adecuado para el análisis SIG, se confeccionarán mapas de distribución de las diferentes poblaciones según los parámetros escogidos, lo que permitirá tener una cartografía para visualizar de manera rápida la distribución de los distintos quimiotipos a lo largo del territorio y se realizará una cartografía de zonas que disponen de los parámetros físicos, geográficos, climáticos y edáficos adecuados para establecer poblaciones de los distintos quimiotipos estudiados.

OBJETIVO 5.- Promover y divulgar el cultivo de PAM como una alternativa real en zonas rurales mediante actividades y materiales de divulgación.
Se realizaran una serie de actividades para promover el cultivo de PAM en las diferentes CC.AA participantes en el proyecto y en otros lugares si somos convocados. Estas consistirían en:

Documentación e informatización de las colecciones silvestres

El soporte informático de gestor de bases de datos será Access. La homogenización de la información, descriptores, numeración de las entradas, códigos, unidades, etc., será la clave para establecer una documentación completa y fiable. Con los datos de caracterización química, se elaborarán tablas independientes para cada especie. A medida que se vaya finalizando la elaboración de los datos, las tablas se irán incorporando a la página web del INIA en el apartado del Laboratorio de Plantas Aromáticas y Medicinales.

Material de divulgación

Se realizará tres hojas divulgativas dirigidas a agricultores y técnicos extensionistas con los resultados agronómicos de los ensayos realizados durante todo el ciclo de cultivo (se incluirán los resultados obtenidos en el proyecto anterior). En esta hoja divulgativa se mostraran los resultados obtenidos por todas las comunidades autónomas participantes en el proyecto. En el caso de no obtener financiación para su publicación, únicamente se colgaría de la página web del INIA en el apartado del Laboratorio de Plantas Aromáticas y Medicinales. Cada publicación será monográfica de una de las especies estudiadas: salvia, romero y espliego. Para la realización de esta publicación:

1.- Se hará el diseño del contenido de la divulgación, en función del público meta. El contenido mínimo será:

  • Rendimientos en planta seca y aceite esencial

  • Dosis de riego y densidad de plantación

  • Época adecuada de recolección para la obtención de aceite esencial y antioxidantes

  • Recomendaciones generales de cultivo

2.- Se recopilarán los datos obtenidos por todas las CC.AA participantes en el proyecto

3.- Se adaptarán los resultados científicos a material de divulgación

4.- Se diseñará y editará el material

Jornadas técnicas de divulgación y/o formación

Dada la experiencia y éxito de las jornadas y cursos organizados y/o impartidos por los participantes del proyecto en anteriores ediciones, se seguirá el mismo modelo.

Cultivos experimentales en fincas de agricultores

En colaboración con sindicatos agrarios y asociaciones profesionales de agricultores, plantearán cultivos experimentales de espliego, romero, salvia y mejorana en diferentes localidades de Castilla y León, Castilla-La Mancha y Cataluña, así como de otros cultivos de especies aromáticas que puedan resultar de interés.

Intercambios entre CC.AA

En las reuniones de coordinación del proyecto se presentarán las actividades de divulgación que se están realizando en las diferentes CC.AA, para que todos los grupos conozcan las actividades más efectivas o la metodología más exitosa que están utilizando los diferentes grupos de trabajo.


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