Reconocimiento de proteínas




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fecha de publicación23.12.2015
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PROTEÍNAS

1) RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS

El objetivo de esta experiencia es extraer proteínas de algunas sustancias para luego reconocer su naturaleza proteica. Para esto utilizaremos los ensayos de Biuret y Xantoproteico y ciertas muestras de  leche, gelatina, clara de huevo y aspartamo.

Materiales y Sustancias:  


-Vaso de Bohemia                       - Leche descremada en polvo

- Varilla de vidrio                         - Gelatina

- Mechero                                   - Clara de huevo

-Soporte                                     - Edulcorante

- Tela metálica                            - Ácido etanoico 2.0M

- Gradilla                                     - NaOH al 10%

- Tubo de ensayo                        - CuSO4 al 1%

- Termómetro                              - Ácido nítrico concentrado

-Papel de filtro

Fundamento de la Técnica:

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas .


Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
Ensayo de Biuret:

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.  El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.



Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.
La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos
Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir a) que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de péptidos generados por una reacción de hidrólisis ácida, los H+ del medio interferirán con la reacción del biuret, ya que ésta necesita de un medio alcalino para la formación del complejo con Cu++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendría un falso negativo como resultado) y c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor. Existen métodos mucho mas sensibles que el biuret (ver mas abajo).

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Figura 1: Reacción de Biuret.




Ensayo de Xantroproteíco:
Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro.  




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Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca. 
La reaccion xantoproteica se puede considerar como una sustitucion electrofilica aromatica de los residuos de tirosina de las proteinas por el acido nitrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH acido.

Descripción de los ensayos efectuados con cada muestra e interpretación de los resultados obtenidos:

1) La leche es: 

a) Una emulsión de materia grasa (principalmente triacilglicéridos) en un medio acuoso.

b) una suspensión de materia proteica (caseína, albumina, globulina) en un medio acuoso.

c) una solución acuosa de sales minerales y lactosa.

Contiene además menores de lecitina, vitaminas, enzimas, nuclétidos, y gases disueltos.

La composición es variable según la especie considerada.
Dentro de los componentes proteicos encontramos:

1) Caseína: complejo de proteínas fosforadas. Constituye el 80% del total de los compuestos nitrogenados.

2) Proteínas de lactosuero: albuminas y globulinas. Se insolubilizan por acción del calor antes de los 100 ºC

3) Proteosas- peptonas: Glicoproteínas poco abundantes en la leche.
CASEÍNA:
Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).

La caseína humana es más rica en cistina y glúcidos que la vaca lo que la hace más apropiada para el bebé.

Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.

La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

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Estructura propuesta para una micela de caseína.


PROCEDIMIENTO
1) Coloque aproximiadamente 25 ml de leche descremada en un vaso de Bohemia

2) Caliente hasta aproximadamente 40ºC agitando con la varilla de vidrio.

3) Adicione ácido etanoico 2,0M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total.

4) Separe el cuágulo de caceína del suero mediante floración.

5) Seque cuidadosamente la caceína con la ayuda del papel de filtro.

6) Separe dos porciones del solido obtenido de aproximadamente 1 cm3 y colóquelas en dos tubos de ensayo.

CARACTERIZACIÓN
a) Reacción de Biuret: Agregue sobre la caseína uno de los tubos 20 gotas de NaOH al 10%. Luego agregue dos gotas de solución de CuSO4 al 1%. Anote sus observaciones.
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En la foto se observa una muestra de caseína luego de efectuado el ensayo de Biuret. Como el color de ésta es violeta por lo tanto podemos decir que existen  por lo menos dos enlaces peptídicos.



b) Reacción Xantoproteica: Agregue sobre la caseína del segundo tubo 10 gotas de HNO3 concentrado. Espere un par de minutos y anote sus observaciones. 
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Luego del ensayo xantoproteico la producción de un producto coloreado Amarillo es una prueba de la presencia de tirosina o triptófano en la caseína. 

GELATINA:

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciónes de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.

Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas. 

http://www.cueronet.com/images/colageno1.jpg

COLAGENO


 El colágeno es un componente abundante en piel, tendones, sistema vascular y otros materiales de desecho, de donde se puede obtener la gelatina comercial, que es un producto de degradación parcial del colágeno, extraida por calentamiento tras un tratamiento en medio ácido o alcalino. Dependiendo del tipo de tratamiento, se obtiene un tipo de gelatina distinto . La gelatina es un material muy útil en tecnología de los alimentos, para la obtención de geles reversibles térmicamente, de punto de "fusión" muy bajo. Estos geles se forman por enfriamiento mediante la unión de cadenas por reconstrucción parcial de hélices del tipo de las del colágeno, pero con grandes zonas desorganizadas. 


Desde el punto de vista nutricional, el colágeno y aún más la gelatina, son proteínas muy desequilibradas en cuanto a su composición de aminoácidos. El colágeno es muy deficiente en triptófano, y la gelatina prácticamente carece de él, ya que el poco que existía se suele destruir en su preparación. La facilidad con la que se proteoliza depende mucho de su estado. El colágeno nativo es bastante resistente a la proteolisis por parte de la mayoría de las proteinas, mientras que el colágeno desnaturalizado se hidroliza fácilmente. 

PROCEDIMIENTO

1) Preparar gelatina

2) Colocarla en dos tubos de ensayo

3) Realizar las reacciones ya mencionadas
Biuret:

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Luego del ensayo de biuret la muestra se torna color violeta por tanto, estamos en presencia de por lo menos dos enlaces peptídicos.
Xantoproteica:

http://1.bp.blogspot.com/-xjzo9lxiw6q/t9qhvkoo4ai/aaaaaaaaace/rvffto4-8nm/s320/foto0583.jpg

Una vez realizado el ensayo Xantoproteico la muestra resulta incolora por ende, da negativa y deducimos que la gelatina  no presenta tirosina o triptófano.

OVOALBÚMINA:


http://1.bp.blogspot.com/-mhforaorulk/t9n5m2vpkfi/aaaaaaaaaba/kx4hukzqy84/s320/ovoalbumina.pngLas proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas, que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos  de glúcidos a la cadena de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovalbúmina, que es una fosfoglicoproteína. 
La ovalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).
La ovalbumina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso 
molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.

PROCEDIMIENTO
1) Romper un huevo

2) Separar la clara de la yema

3) Remover la clara y colocarla en agua

4) Colocar parte de la solución en dos tubos de ensayo

5) Realizar las dos reacciones mencionadas
Biuret: 

http://3.bp.blogspot.com/-en6f_-1rlbu/t9qgaxwfeki/aaaaaaaaabs/ylap9h-ni_s/s320/sin+t%c3%adtulo.png
Después de esta ensayo, la solución se torna color violeta por lo tanto se puede deducir que la ovoalbúmina presenta por lo menos dos o más enlaces peptidicos.
Xantoproteico:
http://3.bp.blogspot.com/-p74mikcxx5o/t9qgrgo06hi/aaaaaaaaab0/6ofso3raa5s/s320/sin+t%c3%adtulo+12.png
Luego de este ensayo, la solución se torna color amarillo por ende esto nos indica la presencia de tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.
ASPARTAMO:


El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa 




http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/aspartame-from-hydrate-xtal-2000-3d-balls.png/200px-aspartame-from-hydrate-xtal-2000-3d-balls.png                                               http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/aspartame.svg/200px-aspartame.svg.png
PROCEDIMIENTO
1) Tomar una punta de espátula de edulcorante y colocarla en dos tubos de ensayo.

2) Agregar un poco de agua en cada uno de los tubos.

3) Realizar las reacciones mencionadas anteriormente.
Biuret y Xantoproteica: 
http://2.bp.blogspot.com/-p8jofmexqb0/t9qixd69aii/aaaaaaaaacm/jmtteqbuhki/s320/foto0587.jpg

Una vez realizado el ensayo de biuret (derecha), la solución no resulta de color violeta por lo tanto, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta enlaces peptidicos.

Después de realizado el ensayo xantoproteico (izquierda), la solucion resulta incolora por ende, la reaccion da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta tirosina o triptófano



GLICINA:



La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.




                 modelo tridimensional                                                  estructura química


PROCEDIMIENTO
1) Colocar una punta de espatula en un tubo de ensayo

2) Agregar un poco de agua

3) Realizar las reacciones mencionadas previamente
Biuret: 
http://3.bp.blogspot.com/-c0dswila55m/t9qjp3qo-2i/aaaaaaaaacc/5e-p4djr0nk/s320/sin+t%c3%adtulo+123.png

Luego de realizado el ensayo, la solución resulta por lo tanto, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta enlaces peptidicos.
Xantoproteica:
http://4.bp.blogspot.com/-owaobo3lytc/t9qj75cfnfi/aaaaaaaaack/zw7psn8iymu/s320/sin+t%c3%adtulo+1234.png

Una vez realizado el ensayo, la solución resulta incolora por ende, la reacción da negativa y deducimos que el aspartamo no presenta tirosina o triptófano.

LOS RESULTADOS OBTENIDOS FUERON LOS SIGUIENTES:
MUESTRA            BIURET         XANTOPROTEICO 
Caseína                     +                            +

Gelatina                     +                             -

Ovoalbúmina              +                            +

Aspartamo                 -                              -

Glicina                       -                              -
Errores sistemáticos y asistemáticos: 
Errores asistematicos: 

Son errores debidos a causas imprevistas o al azar. Son imposibles de controlar y alteran, ya sea por exceso o por defecto, la medida realizada. Este tipo de errores puede eliminarse mediante la realización de estudios estadísticos. Pueden deberse a:

      a) Cambios durante el experimento de las condiciones del entorno. Por ejemplo, debido a corrientes de aire, desnivel en la mesa donde se está midiendo, aumento de temperatura, etc.

  b) Errores de apreciación. Son debidos a fallos en la toma de la medida, asociados a limitaciones (visuales, auditivos, etc.) del observador, o también a la estimación “a ojo” que se hace de una cierta fracción de la más pequeña división de la escala de lectura de los aparatos de medida.
Errores sistemáticos:

Son errores que se repiten constantemente en el transcurso de un experimento y que afectan a los resultados finales siempre en el mismo sentido. Son debidos a diversas causas

 a) Errores de calibración o errores de cero de los aparatos de medida. Por ejemplo, cuando un instrumento de medida no esta calibrado.

 b) Condiciones experimentales no apropiadas. Ocurren cuando se emplean los instrumentos de medida bajo condiciones de trabajo (temperatura, humedad, etc.) diferentes de las recomendadas.
2)DIÁLISIS

FUNDAMENTO TEÓRICO:
La purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una membrana semi permeable (una membrana que permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).

De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales

Para esta práctica son necesarios los siguientes materiales:



MATERIALES: 


-          Dializador(gomita elástica, botella cortada, papel selofan)  

-          Gelatina en solución

-          AgNO3 (Nitrato de Plata)

-          Vaso de Bohemia

-          CuSO4 al 1 %

-          NaOH  al 10%

PROCEDIMIENTO:

PARTE1:

1) Colocar en dos tubos de ensayos muestra de la solución que se pondrá en el dializador.
2) Aplicarle la reacción de Biuret y AgNO3
3) Registrar las observaciones


En agua, tanto el nitrato de plata como el cloruro de sodio de disocian de la siguiente manera:
AgNO3           (Ag +) + (NO3-)  (ac)

              Catión Plata     Anión Nitrato

NaCl              (Na+) + ( Cl -) (ac)

              Catión  Sodio  Anión Cloruro

Para luego:

(Ag+) (ac) + (Cl-)  (ac)      AgCl (s)

                                               Cloruro de Plata

El cloruro de plata es un sólido  blanco, y es su formación lo que determina que el ensayo sea positivo o negativo.

OBSERVACIONES:
Una vez realizados estos pasos, podemos observar que en ambos casos la reacción dio positiva, por ende la solución tiene sales y proteínas.

PARTE 2:

1) Colocar dentro de un dializador una solución con proteínas y sales
2) Sumergir en un vaso de Bohemia con agua destilada( sin ningún desecho) 
3) Luego de 25 minutos, tomar muestras de ambas partes del dializador.
4) Aplicar los ensayos anteriores .
5) Registrar las observaciones.

OBSERVACIONES:


Baso de Bohemia que contenía agua destilada:


a) Biuret: NEGATIVO
b) AgNO3: POSITIVO


A partir de esto, podemos concluir que si bien el AgNO3 nos dio positivo, por lo tanto denotó la presencia de sales, que anteriormente no había dentro del baso de bohemia, el ensayo de Biuret nos dio negativo, lo que quiere decir que no denotó proteínas en la muestra. Esto prueba que las proteínas no atravesaron la membrana semi permeable del dializador.


Muestra dentro del dializador:

a) Biuret: POSITIVO
b) AgNO3: POSITIVO


Una vez obtenidos estos datos, podemos afirmar que a pesar que el ensayo de AgNO3 dio positivo, la concentración de sales de la muestra bajo considerablemente. Como ya dijimos anteriormente, las proteínas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semi permeable del dializador, razón por la cual el ensayo de Biuret aplicado en esta muestra dio positivo. ESTO NOS PERMITE CONCLUIR QUE LA DIÁLISIS FUNCIONO.

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