Departamento de Ingeniería de Procesos y Gestión Industrial




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Universidad Nacional de Tucumán


Departamento de Ingeniería de Procesos y Gestión Industrial




TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: ESPECTROFOTOMETRÍA

Objetivos.

-Emplear los fundamentos de la espectrofotometría para caracterizar compuestos.

-Conocer los criterios para identificación de sustancias o cuantificación de las mismas por espectrofotometría.

-Obtener fingerprints de extractos naturales en la región visible.
Introducción
El análisis de una sustancia, su identificación o su determinación cuantitativa puede hacerse por espectrofotometría.

Esta técnica mide la intensidad de la radiación electromagnética que una sustancia absorbe o libera a diversas longitudes de ondas.
Ondas electromagnéticas
La energía se propaga de un lugar a otro sin transferencia de materia, mediante ondas mecánicas o electromagnéticas. Las únicas ondas que no requieren un medio material para su propagación son las ondas electromagnéticas, puesto que lo hacen en el vacío.
La radiación electromagnética se puede considerar como una condensación de partículas llamadas fotones, en lugar de una serie de ondas. Esta radiación hace que cada fotón tenga una energía proporcional a la frecuencia de la onda asociada, dada por la ecuación de Planck:
E= h . 
donde E es la energía del fotón, h es la constante de Planck y ν es la frecuencia de la onda.

Asimismo, considerando la radiación electromagnética como una onda, la longitud de onda λ y la frecuencia de oscilación ν, están relacionadas por una constante: la velocidad de la luz en el vacío.

c = λ. 


Figura 1

Espectro electromagnético
Las ondas electromagnéticas se agrupan bajo distintas denominaciones según su frecuencia, aunque no existe un límite muy preciso para cada grupo.

El espectro electromagnético es el conjunto de ondas electromagnéticas que existen en el universo, ordenadas en función de sus frecuencias o longitudes de onda, o lo que es lo mismo, en función de la energía que transportan. El espectro electromagnético abarca todas las longitudes de onda desde cero hasta infinito.

Normalmente se divide en siete o más regiones bien diferenciadas según se observa en la Figura 2.



Figura 2

Técnicas colorimétricas
Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de la radiación visible por sustancias coloreadas.

En algunas ocasiones, la muestra que se precisa analizar no posee color por lo que resulta necesario desarrollar color mediante reactivos específicos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que se quiere estudiar.
Cuando los electrones absorben una cantidad de energía h. y pasan a un estado excitado, esa absorción de luz puede ser medida y puesto que cada sustancia tiene diferente estructura, por consiguiente tiene una diferente capacidad para absorber energía. Al determinar la absorbabilidad (absorbancia por centímetro y por unidad de concentración) de una sustancia, podemos identificar un compuesto y también determinar cuantitativamente la concentración de ese compuesto en la solución en que se encuentra.

Existen tres regiones del espectro que se utilizan para estas mediciones:

  1. Ultravioleta (200-400 nm)

  2. Visible (400-750 nm)

  3. Infrarrojo (750-1000nm)


Absorbancia, transmitancia y absorbabilidad

En ecuaciones indicamos absorbancia como:
A= log I° (luz incidente)

I (luz transmitida)
Transmitancia  T= I/I°
Absorbabilidad  a= A /(c.b)

A: absorbancia c: concentración (g/L) b: espesor por donde pasó la luz, ancho de la cuba.

Absorbabilidad molar  E= A.M/c.b M: peso molecular

Determinación cualitativa
Cuando para una determinada sustancia se hace un barrido y se grafica, se determina el rango de la máxima absorción para caracterizar a esa sustancia.

Se puede considerar que cada sustancia tiene una longitud de onda () determinada, donde la absorción es máxima.

Se realiza una gráfica de la absorbancia (A) a diferentes ().



A

Constante la concentración y varía ()

Se determina la absorbancia a la cual se tiene la Máxima absorción  () máx

max 

O sea que para la determinación cualitativa se hace 1° la curva con el barrido a distintas ().

Luego se recurre a tablas de determinaciones de máxima absorbancia como por ejemplo: ()max= 260 nm  adenosina.

Determinación cuantitativa

Una curva de calibración relaciona las A ó T% con las concentraciones, Su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones en la que se trabajará con la sustancia problema.

La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.

Se debe tener en cuenta la Ley de Lambert Beer: “la absorción es proporcional a la concentración”.

Para hacer una determinación cuantitativa se preparan soluciones de concentraciones conocidas de esos compuestos, por ejemplo preparamos soluciones de adenosina con 20%, 40%, 80% y manteniéndose la longitud de onda constante, vemos qué absorbancia tiene cada una de ellas.
Medimos luego una solución problema, y vamos a la recta y buscamos directamente, con la absorbancia la concentración incógnita correspondiente (Cx).

A


20% 40% Cx 80% Concentración

Principio de funcionamiento de un espectrofotómetro

Los rayos de luz en el espectrofotómetro surgen de una fuente, luego con una serie de espejos llega a un prisma que seleccionará la longitud de onda (λ) que necesitamos, así que al mover un tornillo, estaríamos moviendo el prisma.

Los rayos salen paralelos y pasan por dos rendijas: el blanco y la muestra (desconocido).

El blanco puede ser agua ó todos los reactivos que intervienen en la solución, menos la sustancia problema.

Al pasar la luz por el blanco se absorbe una cierta cantidad de luz, luego el desconocido absorberá la luz propia de la sustancia cuya absorbancia queremos conocer de esta manera eliminamos (con el blanco) todo lo que pudiera absorber el agua u otros reactivos que pudieran estar con el desconocido.

Luego, la luz llega a un detector que transforma la energía lumínica en energía eléctrica y eso es lo que finalmente leemos.
Es importante recordar que las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de radiación en la zona visible por sustancias coloreadas. En algunas ocasiones, la muestra que deseamos determinar no posee color por sí misma; en tal caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo de color empleando reactivos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que interesa estudiar.

PARTE EXPERIMENTAL

Para el desarrollo de esta práctica, será necesario retomar 1 cm3 del extracto de zanahoria obtenido según se explica en el práctico N° 4. Adicione 10 cm3 de éter de petróleo. De esta solución tome 1 cm3 y lleve a 4 cm3 con éter de petróleo. Homogeinice, tome una alícuota y realice scanning en el visible. Obtenga λmáx.

Por otro lado, prepare seis diluciones de ϐ - caroteno comercial partiendo de una solución madre de 1 mg/cm3. Construya una curva de calibración. Grafique usando software apropiado (Excel u origin).

Tome una alícuota del extracto de zanahoria, mida absorbancia a λmáx e indique su concentración usando la curva de calibración obtenida.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1-Curso Práctico de Química Orgánica. Brewster, R. Q.; Vanderwerf, C. A.; McEwen, W.1965.

2- Rose, A. en Weissberger: “Techniques of Organic Chemistry”. Vol. 4. 1-174 (Mc Graw-Hill)

3-Prácticas de Laboratorio en Química Orgánica. Guzmán, B.; Ybarra, M. I.; Coronel, C.; Schabes, F.; Mesurado, M. González, M.; Fiori Bimbi, M. V. Tecnografic. 2009.

4-Experimentación en Química. Práctica 8. Universidad del País Vasco. http://cvb.ehu.es/open_course_ware/castellano/tecnicas/expe_quim/practica8.pdf

5- Rose, A. Ind. Eng. Chem. 33 (1944) 594.

6- www.quimicaorganica.net


GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE LABORATORIO 2012 - INGENIERÍA INDUSTRIAL



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