Instituto Politécnico Nacional cecyT “Miguel Othón de Mendizábal”




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fecha de publicación09.01.2016
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Instituto Politécnico Nacional CECyT “Miguel Othón de Mendizábal”

Antibiograma

Bacteriología Clínica




González Ramírez Angelica Guadalupe Jiménez Mendoza Evelyn Gabriela Juárez Martínez Héctor Emilio Ramírez Ensastegui Selene Monserrat Roldan Roldan Jorge Pérez Galindo Vanesa Plata Ortiz Ariana Melissa Ugalde Femat Aime Abigail Viloria García Axl Brandon

16/05/2012

ANTIBIOGRAMA

Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microrganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas.

Objetivos del Antibiograma

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales.

La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas recomendaciones sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica:

Método de Difusión en Disco (Bauer-Kirby)

En la actualidad, la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) es responsable de actualizar y modificar el procedimiento original de Kirby-Bauer a través de un proceso de consenso global. Esto garantiza la uniformidad de la técnica y la reproducibilidad de los resultados de los patógenos a desarrollar con nuevos mecanismos de resistencia y de nuevos antimicrobianos que se han desarrollado para luchar contra estos organismos.

La Publicación de la CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard 11th Edition, representa el estándar para los laboratorios clínicos que realizan pruebas de sensibilidad.

Propósito

La prueba de susceptibilidad de Kirby-Bauer de difusión del disco es para determinar la sensibilidad o la resistencia de los patógenos aerobios y bacterias anaerobias facultativas a los diversos compuestos antimicrobianos con el fin de ayudar a un médico en la selección de opciones de tratamiento para sus pacientes.

El organismo patógeno se cultiva en agar Mueller-Hinton en presencia de diversos antimicrobianos impregnados discos de papel de filtro. La presencia o ausencia de crecimiento alrededor de los discos es una medida indirecta de la capacidad de ese compuesto para inhibir ese organismo.

Medio de cultivo utilizadohttp://www.growth-medium.com/uploadfile/201002/3/2258533809.jpg

El primordial es el Mueller – Hinton debido a los siguientes factores:

  • Su reproducibilidad es aceptable.

  • Baja concentración de inhibidores, condición crítica para evaluar sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina.

  • El crecimiento satisfactorio de patógenos no exigentes.

  • Existir ya gran experiencia en estudios de susceptibilidad.

Para bacterias exigentes se adiciona 5% de sangre: Agar Mueller-Hinton sangre (Streptococcus, Bacterodes) y Mueller-Hinton chocolate (Haemophilus, Neisseria); para ensayos de resistencia a meticilina (oxacilina) en Staphilococcus se utiliza Mueller-Hinton salino (5% de NaCl)


Muller-Hinton Sangre Muller-Hinton Chocolate


Factores que influyen en el Agar

pH: El rango de pH va de 7,2 a 7,4.

Variación de cationes divalentes: Ca y Mg: Afectan los halos de inhibición para aminoglucósidos y tetraciclinas en Pseudomonas aeruginosa.

Profundidad del Agar: La profundidad recomendada de la capa de Agar es de 3 a 5 mm. imagen 019.jpg

Preparación del Inoculo

Se prepara el inoculo con ajuste a la turbidez Mc Farland 0,5 que corresponde aun diámetro de1.5 x10 UFC/ML, directo en caldo de colonias frescas en agar no selectivo.

Escala de Mc Farland

La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina, en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5

La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y una suspensión bacteriana. Creamos 10 estándares (en la tabla aparece la composición de estos) y por espectrofotometría, creamos una recta patrón, de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados,...). La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido sulfúrico.

TUBO

Cl2Ba 1%

SO4H2 1%

u.f.c/ml

1

0,1

9,9

3,0x108

2

0,2

9,8

6,0x108

3

0,3

9,7

9,0x108

4

0,4

9,6

1,2x109

5

0,5

9,5

1,5x109

6

0,6

9,4

1,8x109

7

0,7

9,3

2,1x109

8

0,8

9,2

2,4x109

9

0,9

9,1

2.7x109

10

1,0

9,0

3,0x109

http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:and9gcraqata4_ncslynnmuovytmgpviiwffehvkedwaxvoqmifttipdx7axj4ty

Inoculación de la placa

  1. Con un hisopo estéril en todas las direcciones inocule toda la placa, (estría masiva)

  2. Sembrar la placa de Muller-Hinton de manera de obtener un crecimiento confluente, para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el procedimiento rotando la placa 60° en dos oportunidades más. Deben extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde, porque de lo contrario puede haber problemas en la realización de las lecturas.

1)imagen%20020

imagen%20021

2)

Aplicación de sensidiscos

La aplicación de los sensidiscos con el antibiótico, serán puestos con pinzas previamente esterilizadas, evitando así la contaminación del medio.

La aplicación de los sensidiscos es muy importante, ya que si no se tienen ciertos parámetros, los halos de inhibición pueden sobre ponerse uno sobre otro. Y esto al momento de la medición de los halo, podría haber una alteración en los datos, y abría un diagnóstico erróneo.

Y para quitar esos errores técnicos se tienen los siguientes parámetros:

  • Entre un sensidisco y otro, deberá haber una distancia mínima de 24 mm, entre uno y otro.

  • En las placas de 150mm de diámetro, se pondrán como máximo 12 sensidiscos.

  • En las placas de 100 mm de diámetro se pondrán como máximo 5 sensidiscos.

Siguiendo las siguientes indicaciones, se evitará en menor porcentaje los errores técnicos.

antibio1

Lectura e interpretación de los resultados:

En la lectura de datos, solo hay tres categorías, los cuáles dependen del antibiótico que se utilice y, en este caso, las bacterias a trabajar. Entre otros factores.

Sensible: El microorganismo presenta un gran área de inhibición causada por el fármaco. 95% éxito.

Intermedio: Se presenta un halo de inhibición mas reducido.

sensible

intermedio

resistente

Resistente: Presenta muy poco o casi nada de halo.

Medición de los halos48measure

Después de incuba las placas del antibiograma se procederá a la lectura de este.

Se usa una regla y se mide el diámetro del halo de inhibición.

La longitud obtenida después se comparará con estándares que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el tratamiento.

Clasificación de Antibióticos

Modo de acción de los antibióticos

En general, los antibióticos deben su toxicidad selectiva a las diferencias entre las células eucariotas y procariotas. Su eficacia tóxica es la consecuencia de su capacidad de inhibir una reacción bioquímica específica y esencial, bien sea para la célula eucariota o para la célula procariota. Para que el antibiótico ejerza su acción es necesario que llegue al foco infeccioso, penetre en las bacterias (por difusión o transporte activo) y alcance intracelularmente la concentración necesaria. Una vez dentro de la célula el antibiótico puede ser bacteriostático si inhibe la multiplicación de forma reversible, o bactericida si tiene un efecto letal. En general, cada grupo de antibióticos actúa preferentemente de una forma u otra.

Antibióticos bacteriostáticos: macrólidos, tetraciclinas, cloranfenicol.

Antibióticos bactericidas: betalactámicos, aminoglicósidos, polipeptídicos, polienos.

Los antibióticos de uso en clínica pueden ejercer su acción en una de las siguientes estructuras o funciones:

1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular. La pared celular de las bacterias está compuesta por peptidoglicano. Esta estructura, que es más gruesa en las G+, entre otras funciones protege a la célula de su destrucción por estallido en un medio normal, no hiperosmótico puesto que las bacterias tienen una gran presión osmótica interna (G+: 20 atmósferas; G-: 5 atmósferas). Las células, debido a su crecimiento, están contínuamente sintetizando nuevo peptidoglicano y transportándolo a su sitio adecuado en la pared celular. Varios antibióticos reaccionan con uno o varios de los enzimas que se requieren para completar este proceso originando que la célula desarrolle puntos frágiles en su pared celular debido a la síntesis de peptidoglicano deficiente, lo que origina que sea osmóticamente. frágil. Los antibióticos que producen este efecto se consideran bactericidas ya que la célula debilitada está sujeta a lisis. La mayor parte de estos antibióticos son activos frente a células en crecimiento ya que las células viejas no sintetizan peptidoglicano. Antibióticos que bloquean la síntesis de la pared celular: Bacitracina. Bloquea el transporte de las subunidades de peptidoglicano a su posición en la pared celular. Betalactámicos. Inhiben la síntesis de la pared celular en su última fase interfiriendo la transpeptidación. Son análogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos fármacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a bacterias G- debido a que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintéticas y cefalosporinas tienen efecto también frente a G-.

2.- Alteración sobre la membrana citoplásmica. Una célula con la membrana dañada muere invariablemente por insufiencia metabólica o lisis incluso cuando no está en crecimiento debido a que esta estructura es vital para todas las células ya que entre sus propiedades incluye el actuar como barrera de permeabilidad selectiva. Las sustancias que alteran esta estructura modifican la permeabilidad, permiten la salida de iones K y macromoléculas como los ácidos nucleicos y causan un efecto lítico. Desgraciadamente, debido a la presencia universal de membranas tanto en células microbianas como animales, la mayor parte de estos antibióticos son tóxicos para los humanos. Antibióticos que alteran la membrana citoplásmica: Polimixinas. Interaccionan con los fosfolípidos de las membranas desorganizándolos y aumentando su permeabilidad originando una pérdida de metabolitos esenciales y la muerte bacteriana como resultado final. Las bacterias más susceptibles son las que tienen en su membrana un mayor contenido en fosfolípidos (G-). Polienos. Los antibióticos poliénicos (nistatina, anfotericina B) son activos frente a hongos ya que forman complejos con los esteroles de las membranas de las células fúngicas originando poros hidrofílicos, lo que modifica la permeabilidad de la membrana.

3.- Inhibición de la síntesis proteica. La mayor parte de los inhibidores de la síntesis proteica reaccionan con el complejo ribosoma-mRNA. Aunque las células humanas también tienen ribosomas, los ribosomas de los eucariotas son diferentes en tamaño y estructura de los ribosomas de los procariotas (80S y 70S) por lo que estos antimicrobianos tienen una acción selectiva frente a bacterias. Antibióticos que inhiben la síntesis proteica: Aminoglicósidos (estreptomicina, gentamicina). Actúan uniéndose específicamente y de forma irreversible a un receptor proteico de la subunidad 30S de los ribosomas (en el caso de la estreptomicina, la proteína P10). Esta unión causa, por un lado, el bloqueo de la actividad normal del complejo de iniciación, con lo que se detiene la síntesis proteica y, por otro, distorsiona el codon del locus A, provocando la incorporación de un aminoácido distinto al codificado. De esta manera se forman proteínas anómalas. Tetraciclinas. Se unen a la subunidad 30S de los ribosomas bloqueando la fijación del aminoacil-tRNA al locus A parando la síntesis de proteínas. Cloranfenicol. Se une a la subunidad 50S de los ribosomas impidiendo la transferencia al inhibir la peptidiltransferasa y, por ello, la transpeptidación. Macrólidos (eritromicina). También actúan sobre la subunidad 50S de los ribosomas, impidiendo la translocación, es decir, el paso del peptidil-tRNA del locus A al locus P, previa liberación del tRNA.

4.- Bloqueo de la síntesis de los ácidos nucléicos. La biosíntesis de moléculas de RNA y DNA consiste en una larga serie de reacciones catalizadas por enzimas que al igual que cualquier otro proceso complejo es susceptible de romperse en diferentes puntos. Una inhibición en un punto de la secuencia puede bloquear las reacciones posteriores. Los antibióticos que interfieren en la síntesis de ácidos nucléicos esencialmente actúan bloqueando la síntesis de sus componentes, inhibiendo la replicación o parando la transcripción. Compuestos que bloquean la síntesis de ácidos nucléicos: Sulfamidas (quimioterápicos sintéticos). Se denominan antimetabolitos debido a que interfieren un proceso metabólico esencial en las bacterias. Las sulfamidas son análogos estructurales de un compuesto metabólico natural, el PABA (ácido para-aminobenzoico) que es necesario para que las bacterias puedan sintetizar ácido fólico que a su vez es un componente del coenzima ácido tetrahidrofólico que a su vez participa en la síntesis de purinas y ciertos aminoácidos. Una molécula de sulfonamida tiene gran afinidad por el sitio donde se une el PABA al enzima (dihidro-pteroatosintetasa) que sintetiza ácido fólico. Si esto ocurre se bloquea la síntesis de ácido fólico, lo cual provoca que exista una cantidad insuficiente de ácido fólico con lo que se bloquea la síntesis de ácidos nucléicos. Aunque los humanos requieren también ácido fólico en la síntesis de ácidos nucléicos, los humanos no pueden sintetizar ácido fólico; éste es un nutriente esencial (vitamina) que se obtiene exógenamente a través de la dieta. Ya que los humanos carecen de este sistema enzimático especial para incorporar el PABA al ácido fólico, su metabolismo no puede ser inhibido por las sulfamidas.

Resistencia bacteriana

Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho antibiótico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de dicho espectro se denominan naturalmente resistentes.

El antibiótico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presión de selección. El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido casì siempre al uso intensivo del antibiótico en cuestión.

  • La resistencia natural es un carácter constante de todas las cepas de una misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la inactivìdad de la molécula frente a bacterias identificadas (después del crecimiento) o sospechosas (en caso de antiboterapia empírica). En ocasiones, constituye una ayuda para la identificación, puesto que cìertas especies se caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia natural del Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia natural de la Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).

  • La resistencia adquírida es una característica propia de ciertas cepas, dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio genético ha sido modificado por mutación o adquisición de genes. Contrariamente a las resistencias naturales, las resistencias adquiridas son evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilización de los antibióticos. En el caso de numerosas especies bacterianas, y teniendo en cuenta la evolución de las resistencias adquiridas, el espectro natural de actividad no es ya suficïente para guiar la elección de un tratamiento antibiótico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.

  • Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de resistencia. En general, afecta a varios antibióticos dentro de una misma familia (Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza con todas los ß-lactámicos). En ciertos casos, puede afectar a antibióticos de familias diferentes (Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las ciclinas se cruza con la resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).

  • Un resistencia asociada es cuando afecta a varios antibióticos de familias dìferentes. En general, se debe a la. asociación de varios mecanismos de resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicósidos, macrolidos y ciclinas).

Control de calidad

Las cepas control utilizadas para medir la reproducibilidad de la técnica anterior son:

  • Staphylococcus aereus - ATCC 25923

  • Y Escherichia coli – ATCC 25922

Que deberán incluirse en la prueba diaria.

La FDA también recomienda el uso de las cepas de Pseudomonas aeruginosa – ATCC 27853 susceptible a Gentamicina y Carbenicilina.

Deben emplearse siempre en las mismas condiciones que las cepas problema.

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