Resumen Uno de los principales problemas que enfrenta el mundo actualmente es la contaminación. Es decir, una alteración del sistema biológico causado por el hombre.




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títuloResumen Uno de los principales problemas que enfrenta el mundo actualmente es la contaminación. Es decir, una alteración del sistema biológico causado por el hombre.
fecha de publicación27.11.2015
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Producción de Polihidroxialcanoatos (bioplástico)

Autor: Vázquez Machorro Angélica

Metodología Científica III

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Avenida de los Barrios 1. Col. Reyes Iztacala, Tlalnepantla México. C.P. 54090

Resumen

Uno de los principales problemas que enfrenta el mundo actualmente es la contaminación. Es decir, una alteración del sistema biológico causado por el hombre. Uno de los principales contaminantes son los plásticos ya que su degradación es muy lenta y por tanto hay una gran acumulación. Una de las alternativas para disminuir este problema es la sustitución de polímeros derivados del petróleo por los polihidroxialcanoatos producidos por cepas bacterianas.

Los polihidroxialcanoatos son una familia de poliésteres de ácidos alcanóicos, insolubles en agua, biodegradables y no tóxicos, que contienen un grupo hidroxilo como grupo funcional en adición al grupo carboxilo. La variabilidad de la posición del grupo hidroxilo y del grupo funcional, así como la variedad de monómeros y de grado de polimerización, permiten la biosíntesis de muchos polímeros diferentes con propiedades físicas diversas. Los polihidroxialcanoatos integrados de hidroxi ácidos grasos representan una clase bastante compleja de almacenamiento de polímeros sintetizados por varias especies bacterianas en condiciones de crecimiento caracterizadas por exceso en la fuente de carbono y limitación de otros nutrientes como nitrógeno o fósforo y son depositados como cuerpos de inclusión. Estos polímeros se acumulan en gránulos intracitoplasmáticos y son utilizados como fuente de carbono y energía en condiciones de escasez nutricional.

Estos polímeros poseen propiedades termoplásticas y son muy similares a los polímeros derivados de los hidrocarburos, además de que se producen a partir de fuentes renovables.

Una de las desventajas de los polímeros es su alto costo, éste puede ser disminuido mediante el mejoramiento de los procesos de fermentación y separación, mediante el desarrollo de cepas más eficientes y usando una fuente de carbono más barata.

Se trabajó en el laboratorio aislando bacterias de muestras de agua y suelo, las cuales fueron identificadas a través de varias pruebas bioquímicas, entre ellas está la tinción de Gram, prueba peroxidasa, reducción de nitratos, fermentación de lactosa, entre otras. Posteriormente se incubaron en el medio mínimo M9 y se añadió la fuente de carbono, (diesel y aceite de soya 2%). Se incubaron y finalmente se hizo la detección de polihidroxialcanoatos por medio de una tinción de Sudan Negro B, se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.

Las bacterias obtenidas de las muestras de agua y suelo fueron clasificadas dentro de la familia de las Enterobacteriaceae. También se observó la presencia de gránulos intracelulares en las bacterias de las muestras de agua.

Los polihidroxialcanoatos se sintetiza mediante un camino metabólico que involucra tres enzimas: una beta-cetotiolasa, que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una acetoacetil-CoA reductasa, que convierte este compuesto en 3-hidroxibutiril-CoA, y una polimerasa, que polimeriza los monómeros. Este camino metabólico es el que utilizan la mayoría de las bacterias productoras. Estas enzimas están codificadas por los genes phaB, phaA y phaC.

La fuente de carbono en donde se observaron más gránulos intracelulares de polihidroxialcanoatos fue en la de diesel. Las bacterias productoras de polihidroxialcanoatos pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae. Para realizar la síntesis de polihidroxialcanoatos es necesario que la bacteria tenga los genes que codifican las enzimas productoras de polihidroxialcanoatos.

Abstract

One of the main problems facing the world today is pollution. That is, a biological system disturbance caused by man. One of the main polluters are plastic and its degradation is very slow and therefore there is a large accumulation. One alternative to reduce this problem is the replacement of petroleum polymers polyhydroxyalkanoates produced by bacterial strains.
The polyhydroxyalkanoates are a family of alkanes acid polyesters, water-insoluble, biodegradable and nontoxic, which contain a hydroxyl group as functional group in addition to the carboxyl group. The variability of the position of the hydroxyl group and the functional group and the range of monomers and polymerization degree, allowing the biosynthesis of many different polymers with different physical properties. The polyhydroxyalkanoate composed of hydroxy fatty acids represent a rather complex class of storage polymers synthesized by several bacterial species in conditions characterized by excessive growth in the carbon source and limitation of other nutrients such as nitrogen or phosphorus and are deposited as inclusion bodies. These polymers are accumulated in intracytoplasmic granules and are used as carbon and energy source under conditions of nutritional shortage.
These polymers have thermoplastic properties and are very similar to the polymers derived from hydrocarbons, in addition to being produced from renewable sources.
One disadvantage of polymers is their high cost, this can be reduced by improving the processes of fermentation and separation, through the development of strains using a more efficient and cheaper carbon source.
He worked in the laboratory by isolating bacteria from water and soil samples, which were identified through various biochemical tests, including Gram's stain, peroxidase test, nitrate reduction, fermentation of lactose, among others. Subsequently incubated in M9 minimal medium and was added carbon source (diesel and soybean oil 2%). Were incubated and finally made the detection of polyhydroxyalkanoates by a Sudan Black B staining was observed under the microscope with immersion objective.
The bacteria obtained from soil and water samples were classified within the family Enterobacteriaceae. We also observed the presence of intracellular granules in the bacteria in water samples.
The polyhydroxyalkanoate is synthesized through a metabolic pathway involving three enzymes: a beta-ketothiolase which condenses two molecules of acetyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, an acetoacetyl-CoA reductase, which converts this compound to 3-hydroxybutyryl-CoA, and a polymerase, which polymerizes the monomers. This metabolic pathway is used by most of the producing bacteria. These enzymes are encoded by genes Phab, phaa and phac.
The carbon source where most granules were observed intracellular polyhydroxyalkanoate was in the diesel. Polyhydroxyalkanoates-producing bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae. For the synthesis of polyhydroxyalkanoates is necessary that the bacteria have the genes encoding the polyhydroxyalkanoate-producing enzymes.
Introducción

Uno de los principales problemas que enfrenta el mundo actualmente es la contaminación, es decir, una alteración en los sistemas biológicos por factores humanos. Existen tres tipos de contaminación: la química, que son los hidrocarburos y los fertilizantes; la biológica como las frutas, verduras y restos animales y, la física en donde se encuentran las latas, vidrios y plásticos. Estos tres tipos de contaminación las podemos encontrar en el aire, suelo y agua.

Entre los más fuertes contaminantes se encuentran los polímeros sintéticos, éstos producen cerca de 60 millones de toneladas solo en América latina, su gran acumulación se debe a su lenta degradación, por lo cual provocan un alarmante daño ecológico. Estudios demuestran que el plástico no se degrada ya que en los mares se han encontrado gran cantidad de partículas de plástico, esto se debe a que con el paso del tiempo se fragmenta cada vez en partes más pequeñas.

Una alternativa para disminuir este problema es el uso de bioplástico compuestos por polihidroxialcanoatos. Los polihidroxialcanoatos son polímeros lineales de ®-3-hidroxiacidos en los cuales el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace tipo éster con el grupo hidroxilo del monómero siguiente. Los polihidroxialcanoatos se depositan intracelularmente en formas de cuerpos de inclusión y pueden llegar a representar más del 90% del peso seco celular.

Además de sus propiedades termoplásticas, los polihidroxialcanoatos poseen otras características interesantes: su biodegrabilidad y el hecho de que pueden ser producidos a partir de recursos renovables, Su producción fermentativa utiliza productos derivados de la agricultura como fuente de carbono. En la naturaleza los microorganismos son capaces de degradar los polihidroxialcanoatos, mediante la acción de PHA depolimerasas y PHA hidrolasas, hasta CO2 y agua. De esta manera, mientras que los plásticos derivados de hidrocarburos utilizan las escasas reservas petroquímicas del planeta, la producción de PHA se basa en la utilización de recursos renovables.

Varias especies bacterianas han sido probadas para la producción de polihidroxialcanoatos. El primer polihidroxialcanoato descubierto fue el poli (3-D-hidroxibutirato, PHB), un homopolímero que fue detectado en la especie Bacillus megaterium en el año 1925.Estudios realizados por Weiner, en 1997, sobre las potencialidades productivas de los procariontes marinos, demostraron la capacidad de algunas bacterias de este origen para producir polihidroxialcanoatos.

El objetivo de este estudio fue determinar la fuente de carbono con mayor producción de polihidroxialcanoatos e identificar las bacterias productoras de éste.

Materiales y métodos

Cepa empleada

Aislamiento e identificación:

Se tomaron muestras de zonas estancadas y sin movimiento del lago de Chapultepec y muestras de suelo de la Facultad de Estudios superiores Iztacala. Se tomó 1mL de agua del lago y se pesó 1g de suelo, posteriormente se hicieron diluciones 1:100 en agua estéril.

Las bacterias de las muestras se mantuvieron en agar nutritivo a una temperatura de 38ºC, después de su crecimiento se fueron aislando.

La cepa Pseudomona aeruginosa fue donada por la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la Fes Iztacala y se mantuvo en agar Mueller-Hinton a 38ºC.

La identificación se realizó a través de pruebas bioquímicas. Se realizaron 6 pruebas bioquímicas.

-Tinción Gram:

Se realizó un frotis con las bacterias de agua, se le agregó violeta cristal y se esperó 1 min., pasado éste tiempo se lavó con agua destilada, posteriormente se agregó lugol y se dejó 1min., se lavó con alcohol- acetona y nuevamente se lavó con agua destilada, finalmente se contratiñó con safranina durante 1min y se enjuago con agua destilada. Éste procedimiento se repitió con las bacterias de la muestra de suelo.

-Prueba de peroxidasa

Se tomó una colonia de las muestras de agua y se colocó en un portaobjetos, después se agregó peróxido de Hidrogeno al 3% y se observó la reacción.

-Prueba de fermentación de Lactosa

Se preparó agar MacConkey y se sembraron las bacterias, se incubaron a 38ºC y se observó la coloración del agar y de las colonias.

-Prueba utilización de citrato

Se preparó agar citrato de Simmons y se esterilizó, posteriormente se vació en tubos de vidrio con rosca y se dejo solidificar en pico de flauta. Se inocularon los tubos con las bacterias y se observó la reacción de 24 a 48 horas.

-Prueba de reducción de citrato

Se preparó y esterilizó agar citrato, se sembraron las bacterias. Al transcurrir de 24 a 48 horas se le agregó alfa-naftilamina y acido acético 5N. Se observó el cambio de coloración.

-Morfología de las colonias

Se observaron las colonias con un microscopio estereoscópico y se anotaron las características de las colonias.

Medio de producción de polihidroxialcanoatos

Se preparó el medio mínimo M9:

Na2HPO4…………………….1.12g

KH2PO4……………………… .4g

NaCl……………………………...2g

MgSO4………………………… .09g

H2O……………………………..200mL

Se esterilizó el medio y posteriormente se vació en tubos con rosca previamente esterilizados. En cada tubo se agrego 9.8 Ml de medio mínimo y .2mL de fuente de carbono.

Como fuente de carbono se utilizó aceite de soya y diesel.

Cada tubo fue inoculado y se mantuvieron a una temperatura de 38ºC por 5 días.

Detección de polihidroxialcanoatos

La detección de polihidroxialcanoatos se realizó mediante tinción lipofílica con Sudán Negro B: .1g de Sudán Negro B se, dispersó en 1mL de acetato de etilo y se centrifugó a 60xgx1min. Se añadieron 9mL de etilenglicol al sobrenadante. Con esta solución se cubrieron extensiones previas de los cultivos en láminas de portaobjetos, calentando suavemente sin ebullir durante 5 min. Después, las extensiones se decoloraron con xilol, se secaron y se contratiñeron con safranina. Al observar con lente de inmersión los gránulos de PHB se colorean de gris-negro y la célula vegetativa de rosado.

Resultados

Prueba

Muestra suelo 1

Muestra agua 2

Muestra agua 3

Tinción Gram

Gramnegativa

Gramnegativa

Gramnegativa

Peroxidasa

Positiva

Positiva

Positiva

Fermentación lactosa

Positiva

Positiva

Positiva

Utilización citrato

Positiva

Positiva

Positiva

Reducción nitratos

Positiva

Positiva

Positiva

Morfología

Tamaño: 1mm

1mm

2mm

 

Forma: Redonda

Redonda

Redonda

 

Elevación: Convexa

Plana

Plana

 

Margen: Entero

Lobulado

Ondulado

 

Color: Blanquecino

Blanco

Amarillento

 

Superficie: Brillante

Brillante

Brillante

 

Densidad: Traslucida

Opaca

Opaca

Tabla 1. Resultados de las pruebas bioquímicas.



Fig. 1. Bacteria con gránulos intracelulares.

Discusión

En la tabla 1 se observan los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas. Las bacterias identificadas son de la familia Enterobacteriaceae debido a que son gramnegativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos, son de fácil cultivo, son capaces de reducir nitratos en nitritos, son anaeróbicos facultativos, fermentadores de carbohidratos, además algunas especies pueden vivir en agua, tierra o en animales acuáticos.

En la figura 1 se puede observar a la bacteria con gránulos intracelulares, es decir, con polihidroxialcanoatos.

Los polihidroxialcanoatos son el almacenamiento universal de compuestos de carbono y energía en procariotas, son acumulados intracelularmente en forma de cuerpos de inclusión durante el tiempo de excesos de fuente de carbono.

PHA sintetasa es la enzima llave de la síntesis de PHA y cataliza la polimerización de hidroxiacil-coenzima A a PHA y CoA libre.

En la figura 1 se puede observar a la bacteria con gránulos intracelulares, es decir, con polihidroxialcanoatos.

El polímero se sintetiza mediante un camino metabólico que involucre tres enzimas: una beta-cetotiolasa, que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una acetoacetil-CoA reductasa, que convierte este compuesto en 3-hidroxibutiril-CoA, y una polimerasa, que polimeriza los monómeros. Este camino metabólico es el que utilizan la mayoría de las bacterias productoras.

Estas enzimas están codificadas por los genes phaB, phaA y phaC.

Existen otras proteínas involucradas en la regulación de la biosíntesis del polímero y en la formación de los gránulos intracitoplasmáticos. Se han descrito varias proteínas estructurales. Una de ellas son las fasinas, que se encuentran asociadas a los gránulos de PHA. Estas proteínas podrían afectar el tamaño y la pureza de los gránulos, ya que son importantes para la forma que el granulo adquiere intracelularmente e impiden que otras proteínas puedan asociarse inespecíficamente, lo cual simplifica la purificación del polímero.

Conclusiones

  • El bioplástico es termoplástico y posee propiedades similares a las de los plásticos derivados del petróleo.

  • En las bacterias alimentadas con diesel se observaron gránulos de PHA.

  • Se necesitan tener los genes necesarios para la formación de enzimas productoras de PHA.

  • Las bacteria encontradas en las muestras de agua y suelo son de la familia Enterobacteriaceae.

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