Microbiología de alimentos
Practica 2: Cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
José Luis Almanza Rubio 205204
Raúl Eduardo Orozco Mena 201318
Resumen
En esta práctica se realizó un estudio sobre la cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, en el cual se mantuvieron constantes las condiciones de operación (temperatura ambiente sin agitación) para evaluar el cambio de los en el crecimiento de las unidades formadoras de colonias (UFC), así como en los parámetros de pH, degradación de glucosa y contenido de alcohol con respecto al tiempo. Se realizó una gráfica del crecimiento de las UFC con respecto el tiempo, la cual mostró las 4 etapas de crecimiento del microorganismo. El pH del medio obtuvo un valor inicial de 6.11 el cual fue disminuyendo con respecto al tiempo hasta alcanzar el valor mínimo de XXX. No fue posible determinar la cantidad de etanol debido a que no se obtuvieron lecturas claras del refractómetro. Al determinar la cantidad de glucosa del medio durante los diferentes tiempos de crecimiento se obtuvieron valores fuera del rango de la curva de referencia de glucosa.
Antecedentes
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado por su importancia en la industria panadera y vitivinícola, además de su capacidad de producir etanol a partir de carbohidratos. Al ser incubado, este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es cultivado en medios líquidos con glucosa como fuente de carbono:
La fase lag.- Es un periodo de adaptación en el cual la célula se prepara para dividirse.
La fase logarítmica.- Las células alcanzan su máxima velocidad de duplicación y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce etanol.
El cambio diáuxico.- Al disminuir la concentración de glucosa, las células atraviesan por el cambio diáuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay división, y la célula cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio.
La fase postdiáuxica.- En la fase postdiáuxica las células usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase logarítmica e incrementan su resistencia al estrés gradualmente.
La fase estacionaria.- Por último, la fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no hay división celular. En esta fase, las células acumulan carbohidratos de reserva como trehalosa y glucógeno, alcanzan el máximo nivel de resistencia a estrés y su pared celular se vuelve más gruesa y resistente a la digestión por liticasa (Folch-Mallol et al., 2004).
Materiales y métodos
Material
Matraces Erlenmeyer
Micro pipetas de 1ml y 10 µl
Puntas de micro pipeta
Tubos de cultivo
Tubos Falcón
Tubos eppendorf
Placa de Neubauer
Reactivos
Caldo YPG
Reactivo NDS
Cultivo
Saccharomyces cerevisiae
Equipo
Campana de extracción
Potenciómetro
Microscopio
Espectrofotómetro
Refractómetro
Métodos
El estudio de la cinética de crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae se realizó en el laboratorio de microbiología III y en el laboratorio de micología de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua.
Preparación del medio de cultivo
Se preparó un medio de cultivo con glucosa 5 g/L , 5% de extracto de malta y 1% de agar YPG diluidos en 200ml de agua destilada.
Activación de la cepa Saccharomyces cerevisiae
Se tomaron 2 azadas de la cepa Saccharomyces cerevisiae con una aza de nicromo previamente esterilizada y se vertieron en 25 ml del medio de cultivo contenidos en un tubo falcón, se mantuvo en agitación constante durante 24 horas a temperatura ambiente.
Inoculación en los medios de cultivo
Se tomaron 2 ml del tubo falcón con la Saccharomyces cerevisiae activa y se vertieron en 250 ml del medio de cultivo contenidos en un matraz Erlenmeyer. Se prepararon 3 matraces los cuales se mantuvieron a temperatura ambiente sin agitación.
Medición de las UFC
Se realizaron las mediciones de las UFC y pH en lapsos de tiempo predeterminados. La medición de las UFC se realizó empleando una cámara de Neubauer y un microscopio. Cuando la numeración fue muy grande para contar se realizaron diluciones en caldos peptonados para las lecturas de las UFC. Los lapsos de tiempo y las diluciones realizadas para efectuar la medición de las UFC se describen en la tabla 2. Se tomaron 100µl de la muestra y se colocaron en la cámara de Neubauer para proceder a contar las células viables, el número de células contabilizadas se multiplicaron por el factor de 50,000 para conocer el número real de UFC/ml.
pH
Se tomaron 25 ml del medio de cultivo inoculado y se vertieron en un tubo falcón, después se realizó la medición del pH utilizando un potenciómetro.
Alcohol-Glucosa
El restante de los 25 ml que se tomaron en el tubo falcón se centrifugaron a 3000 rpm para separar la biomasa del caldo, después se tomaron muestras de 2 ml por triplicado en tubos eppendorf y se congelaron. Al terminar todas las corridas se descongelaron los tubos eppendorf para proceder con la medición de Alcohol y Glucosa.
Alcohol
Para medir el contenido de alcohol se utilizó un refractómetro, sin embargo no se lograron obtener lecturas claras al correr las soluciones de alcohol a concentraciones conocidas, por lo que se opto no evaluar el contenido de alcohol por este método.
Glucosa
Para medir el contenido de glucosa se utilizó el método espectrofotométrico DNS. Para realizar la curva de calibración a partir de una solución stock de glucosa 40 mM y por dilución con agua destilada, preparó una gama de soluciones de distinta concentración, como se indica en la Tabla 1.
Reactivo de DNS. Acido 3,5-dinitrosalicílico
Se disolvió 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 300 g de tartrato sódico potásico en 200 ml de hidróxido sódico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml de agua destilada) y se diluyo hasta 1000 ml con agua destilada. El reactivo se guardó en un recipiente oscuro para mantener la estabilidad.
Una vez preparado el reactivo y establecida la curva de calibración de la glucosa se procedió a medir el contenido de glucosa de las muestras. En un tubo de ensaye se agregaron 1 ml de reactivo DNS, 1ml de muestra y 0.8 ml de agua. Los tubos se sometieron a un baño maría a 100°C durante 10 minutos seguido por un baño de hielo durante 5 minutos. Después se procedió a medir la muestra en el espectrofotómetro.
En la determinación de glucosa, también se llevó a cabo una prueba para evaluar el efecto de la dilución de la muestra antes y después de que esta sea sometida a los tratamientos térmicos.
Resultados
Crecimiento Microbiológico
Al medir el crecimiento de la se observaron claramente las etapas de crecimiento (Tabla 1). Estas se volvieron aún más fácil de distinguir una vez se graficaron los datos de crecimiento con respecto al tiempo (figura 1).
Tabla 1. Observaciones de crecimiento microbiológico en el medio a diferentes tiempos y su efecto en el pH.
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Tiempo
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Observaciones (UFC/ml)
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pH
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0
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55x104
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6.11
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1
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185 x104
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6.08
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2
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162 x104
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6.08
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3
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231 x104
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6.07
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4
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814 x104
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6.06
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5
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680 x104
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6
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6
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175 x105
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5.79
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7
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342 x105
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5.74
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8
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530 x105
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5.63
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9
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146 x106
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5.21
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10
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147 x106
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5.23
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11
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189 x106
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5.3
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12
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460 x105
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5.19
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Figura 1. Crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae.
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pH
Al graficar los datos obtenidos de pH se observó un claro descenso del pH con respecto al tiempo (Figura 2), lo cual indica que además de la fermentación de la glucosa para la formación de alcohol también se llevaron a cabo reacciones alternas productoras de ácidos orgánicos. Esto concuerda con lo encontrado por Pramanik (2003) quien encontro que a un pH mayor a 5 la Saccharomyces cerevisiae produce subproductos como glicerol y ácidos orgánicos.
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Figura 2. Cambios de pH con respecto al tiempo.
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Medición de glucosa
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Figura 2. Comparación de la curva de calibración de la glucosa (izquierda) y la curva del consumo de glucosa por la Saccharomyces cerevisiae (derecha).
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Tanto en la medición de glucosa como en la de alcohol no se lograron obtener datos claros que den indicación del metabolismo de la levadura. En el caso del alcohol esto se debió a que no se lograron obtener lecturas claras en el refractómetro sobre soluciones de concentraciones conocidas de etanol.
En cuanto a la medición de glucosa el error de medición se debió a la alta concentración de glucosa en el medio, por lo que se recomienda llevar acabo aún más diluciones de la muestra problema para que esta pueda ser corrida de manera adecuada en el espectrofotómetro.
Al comparar los dos métodos de dilución de muestras para la determinación de glucosa por el método DNS utilizando una prueba de t se encontró con un nivel de confianza del 95% que no existe diferencia entre los valores obtenidos por los dos métodos. Además estos valores obtenidos fueron graficados para comparar la forma de las dos curvas (Figura 3).
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Figura 3. Comparación de las curvas de consumo de glucosa por la Saccharomyces cerevisiae.
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Conclusiones
Se encontró que la Saccharomyces cerevisiae presento todas sus etapas de crecimiento al ser incubada en un caldo YPG.
Aunque no se logró medir el contenido de alcohol, las muestras presentaron el aroma característico de la fermentación alcohólica, lo que indica que la levadura si llevo a cabo esta vía metabólica.
Recomendaciones
Se recomienda realizar un mayor número de diluciones de la muestra problema cuando se va a determinar el contenido de glucosa, ya que los valores obtenidos en esta práctica se encontraban muy por encima o muy por debajo de lo establecido en la curva de calibración.
Bibliografía
Folch-Mallol, J.L. Garay-Arroyo, A. Lledías, F. Covarrubias-Robles, A.A. 2004. La respuesta a estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae” Revista latinoamericana de microbiología. Vol. 46, No. 1-2. January - March. 2004. April - June. 2004. pp. 24 – 46.
Pramanik, K. 2003. Parametric Studies on Batch Alcohol Fermentation Using Saccharomyces Yeast Extracted from Toddy. J. Chin. Inst. Chem. Engrs., Vol. 34, No. 4, 487-492, 2003.
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