2. microorganismos utilizados en biotecnologíA

Los microorganismos que sintetizan productos útiles para nuestra especie son varios centenares de especies de entre las más de 100.000 que existen en la naturaleza.
Se pueden distinguir tres grupos de microorganismos de interés industrial: las bacterias, las levaduras y los mohos. En la siguiente tabla aparecen algunos de estos microorganismos, junto con los productos industriales obtenidos gracias a ellos.

MICROORGANISMOS	PRODUCTO
Saccharomyces cerevisiae (L)	Pan , cerveza, vino, etanol, bebidas destiladas (ron, brandy, whisky, ...)
Streptococcus termophilus (B)	Yogur
Lactobacillus bulgaricus (B)	Yogur
Penicillium chrysogenum (M)	Penicilinas
Streptomyces sp. (B)	Otros antibióticos (estreptomicina, cloranfenicol, eritromicina y tetraciclina)
Escherichia coli (B)	Insulina, somatotropina (hormona del crecimiento)
Bacillus thuringiensis (B)	Insecticidas

L= levadura, B= bacteria, M= moho


3. PRINCIPALES TÉCNICAS UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGÍA.
3.1 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN GÉNICA.
La Ingeniería Genética ha desarrollado una serie de técnicas que permiten introducir material genético foráneo en el interior de las células. A estas técnicas se les ha dado diferentes nombres como tecnología del ADN recombinante (ya que se obtiene una combinación de segmentos de ADN que no se encuentran juntos de manera natural), manipulación genética y clonación génica.
Gracias a estas técnicas se han obtenido, mediante microorganismos manipulados genéticamente, productos de gran interés para el hombre. Ejemplo bien conocido es la transferencia del gen de la insulina humana a la bacteria Escherichia coli o el de la hormona del crecimiento humana.
Desde hace tiempo se sabe que la transferencia de material genético entre células se produce en la naturaleza entre algunas bacterias, proceso denominado transformación, pero para que sea operativo debe ocurrir entre bacterias de la misma especie y el material genético ha de integrarse en el cromosoma bacteriano.
Para realizar la transferencia de forma artificial, así como para su análisis, se han desarrollado unas técnicas de ingeniería genética. En esencia son las siguientes:

1. 
   Obtención del fragmento de ADN que contiene el gen que se quiere clonar.
   
2. 
   Inserción de dicho fragmento en una molécula de ADN apropiada, que sirve como vehículo o vector de clonación.
   
3. 
   Introducción del vector de clonación con el gen de interés en una célula de otro organismo diferente, a la que se denomina célula hospedadora. O lo que es lo mismo, transformación de células mediante vectores.
   
4. 
   Detección y selección del gen clonado.
   

- Fragmentación del ADN.
El ADN de cualquier organismo puede ser cortado en fragmentos lo suficientemente cortos para ser analizados y manipulados, gracias a las enzimas de restricción o restrictasas. Estas enzimas son endonucleasas presentes en muchas bacterias, y que tienen la propiedad de cortar el ADN extraño que penetra en ellas. Lo cortan por sitios específicos dentro de la secuencia de reconocimiento, formada por 4 pares de bases, que, en la bacteria original, están protegidas (por metilación de algunas bases) para evitar que se destruya su propio ADN.

Estas enzimas, que actúan como auténticas "tijeras biológicas", cortan el ADN de forma que en cada extremo queda un trozo de hebra monocatenaria formado por las bases de la secuencia de reconocimiento (no todas las enzimas cortan de esta manera). Estos extremos se denominan cohesivos o "pegajosos", ya que es por ellos por donde se pueden unir otros fragmentos de ADN cortados por la misma enzima de restricción, al ser sus bases complementarias.



Por último, los fragmentos obtenidos se pueden separar por tamaños (según el número de pares de nucleótidos que llevan) mediante electroforesis sobre geles.

Con esta técnica, la mezcla de fragmentos de ADN se mueven sobre un gel, en el que hay un campo eléctrico, de manera que los fragmentos más grandes se mueven más lentamente.
Posteriormente se cortan las bandas de gel y se ponen en distintas soluciones, consiguiendo así la separación de los distintos fragmentos.



Lógicamente antes de fragmentar el ADN habrá que obtener éste de la célula. Esto se puede hacer de dos maneras:

• 
  Obtención del ADN de una célula procariota.
  

Se utiliza este procedimiento cuando el gen que se desea clonar procede de una célula procariota, que no contiene intrones.

Para obtener el ADN de un extracto celular (resultado de romper un conjunto de células), se aplica un tratamiento con alcohol. Las moléculas de ADN se unen entre sí formando unos agregados que se enrollan fácilmente en una varilla de vidrio.

Posteriormente, las grandes moléculas de ADN se pueden obtener puras mediante una centrifugación, debido a su elevada densidad.

• 
  Obtención de un ADN complementario del ARN mensajero (ADNc).
  

Este procedimiento se utiliza para clonar genes procedentes de células eucariotas, cuyo ADN contiene intrones (algunos genes tienen más de 50 intrones, información genética no codificante).

En general, el tejido donde se exprese un determinado gen suele contener gran cantidad del correspondiente ARNm (por ejemplo en el páncreas se encuentra mucho ARNm de la insulina). El ARNm aislado sirve de molde para producir ADN complementario mediante el proceso de transcripción inversa dirigido por la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. Pero para ello se necesita un cebador, en este caso es un oligonucleótido-T, ya que las moléculas de ARNm eucariótico contienen una cola poli A en el extremo 3'.

En una primera etapa se forma una molécula híbrida constituida por una cadena de ARN y otra de ADN. Después la cadena de ADN forma una especie de lazo que hace de cebador para la otra cadena de ADN.

- Inserción del fragmento de ADN en un vector de clonación.
Una vez obtenido el fragmento de ADN con el gen elegido, debe unirse a un vector de clonación antes de introducirlo en la célula hospedadora.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, generalmente circulares, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras, independientemente de los cromosomas de éstas. Los vectores de clonación más empleados son: plásmidos, virus bacteriófagos y cósmidos (vectores sintéticos, que combinan características de plásmidos y de fagos).
Lo que se hace para insertar el fragmento de ADN, que contiene el gen de interés, en un vector de clonación, es cortar con la misma enzima de restricción, tanto el ADN que se desea insertar, como el ADN del vector, con el fin de que ambos presenten extremos cohesivos capaces de unirse.
La unión se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN ligasas, que sellan la unión formando enlaces covalentes entre bases nitrogenadas adyacentes. El resultado es una molécula de ADN recombinante, que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

- Introducción del ADN recombinante en células hospedadoras.
Una vez obtenida la molécula de ADN recombinante, es necesario introducirla en una célula hospedadora para que se replique dando nuevas copias y para que el gen de interés pueda expresarse y producir proteínas.

Escherichia coli es el organismo más utilizado con este fin. Pero, incluso con las mejores técnicas sólo un pequeño número de bacterias capta realmente el ADN. Por esa razón es necesario disponer de algún método para seleccionar las células que se han transformado. Lo que se suele hacer es marcar selectivamente los vectores usados, es decir, añadirles genes que les proporcionen características fácilmente identificables. Por ejemplo genes que les den resistencia a uno o más antibióticos y que les capacita para crecer en un medio con dicho antibiótico.

- Detección y selección de células con ADN clonado.
Algunas veces los genes clonados se expresan en la célula hospedadora, esto ocurre cuando la maquinaria de transcripción y traducción es semejante a la de la célula de la que procede. En este caso, se detecta directamente la proteína producto del gen de interés.
Sin embargo, en otros casos, el producto del gen clonado no se puede detectar tan fácilmente, por lo que se recurre a otros métodos:

• 
  Como ya se ha mencionado, además del gen clonado, el vector de clonación lleva también otro gen, de fácil detección fenotípica, al que se denomina gen marcador.
  
• 
  En otros casos, el gen se detecta mediante una sonda, que consiste en una cadena de ADN, complementaria de una de las hebras de ADN del gen clonado, marcada radiactivamente.
  

Esta cadena hibridará con el gen clonado, revelando su presencia por autorradiografía.

• 
  Otro método empleado consiste en la utilización de anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen.
  

3.2 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
En los trabajos de Biotecnología se necesitan múltiples copias de un determinado fragmento de ADN para poder manipularlas. Para conseguirlo se utilizan dos métodos:

• 
  La clonación génica o tecnología del ADN recombinante (que acabamos de ver)
  
• 
  La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Poymerase Chain Reaction).
  

Gracias a la PCR se pueden replicar pequeños fragmentos de ADN "in vitro" (sin necesidad de utilizar células vivas), a una velocidad muy superior a la lograda mediante clonación. Esta técnica es capaz de generar 100.000 millones de moléculas idénticas en una tarde, a partir de una sola molécula de ADN. Este ADN puede proceder de una muestra de un tejido de un hospital, de un cabello humano, de una gota de sangre o de semen en la escena del delito, de tejido de cerebro momificado o de un mamut muerto hace 40.000 años y conservado enterrado en el hielo.

La técnica de la PCR es la siguiente. En primer lugar, se diseñan dos oligonucleótidos sintéticos (de 18 a 30 nucleótidos). Sus secuencias han de ser complementarias a los dos extremos 3' de la región de ADN que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos se utilizarán como cebadores para la replicación de cada hebra de ADN.
Por esta razón no se puede amplificar una región de ADN si no se conoce la secuencias de sus dos extremos.
La PCR se lleva a cabo en 3 etapas:

1. 
   Desnaturalización. El fragmento de ADN que se desea replicar se desnaturaliza para separar las dos hebras de la doble hélice. Esto se consigue calentando el ADN a temperaturas elevadas, entre 68 y 95º C.
   
2. 
   Templado o hibridación. A continuación se lleva a cabo un enfriamiento rápido (entre 37 y 65ºC) que permite la hibridación de cada hebra con un oligonucleótido (cebador).
   
3. 
   Elongación o replicación. Etapa en la que la ADN polimerasa elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La replicación transcurre en sentido 5'→3' a partir del extremo 3' de cada cebador, empleando como sustrato los 4 dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalización (siguiente ciclo).
   

Las tres etapas que se acaban de describir constituyen un ciclo de síntesis y dura unos 5 minutos.

Para conseguir una amplificación útil se requiere una sucesión de ciclos de desnaturalización, hibridación y replicación (entre 20 y 40). Con 20 ciclos se consiguen un millón de copias. Hoy en día se realiza de forma automática mediante instrumentos especializados (termocicladores).

Cuando la PCR se empleó por primera vez, la ADN polimerasa utilizada en el proceso se obtenía de E. coli. Pero debido a la elevada temperatura para lograr la desnaturalización del ADN bicatenario, la enzima se desnaturalizaba también y era preciso añadirla de nuevo en cada ciclo, lo que encarecía el proceso. El problema se resolvió utilizando la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en aguas termales, por lo que todas sus enzimas, incluidas las ADN polimerasas, son funcionales a temperaturas muy elevadas.
La ADN polimerasa de esta bacteria, conocida como Taq polimerasa, es estable hasta 95º C.


3.3 MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER.
Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN. Hasta los años 70 era difícil y costoso secuenciar incluso fragmentos de sólo 5 a 10 nucleótidos. Primero fue el método químico de Maxan y Gilbert (1977), y después el método enzimático de Sanger (1980), los que abrieron camino a este gran objetivo.
Estos dos métodos pioneros de la secuenciación tienen en común algunos aspectos, como la utilización de fragmentos del ADN original cortados con enzimas de restricción, el marcaje del ADN de forma radiactiva o química (compuestos fluorescentes), el empleo de métodos electroforéticos para separar los fragmentos generados, etc.

Con frecuencia, las muestras se amplifican por PCR para disponer de suficiente cantidad.
Actualmente el método químico de secuenciación ha sido desplazado por el enzimático, de ahí que sólo estudiemos este último.
MÉTODO DE SECUENCIACION DE SANGER.
Se denomina también secuenciación didesoxi, por ser necesarios didesoxirribonucleótidos.

Los didesoxirribonucleótidos (ddNTP) son compuestos similares a los 2'-desoxinucleótidos, pero que también han perdido el grupo -OH del carbono 3', en su lugar tienen un grupo -H. Debido a esta característica, cuando la ADN polimerasa incorpora un 2'-3'-didesoxirribonucleótido a la cadena de ADN, ésta ya no puede crecer puesto que carece del grupo -OH en posición 3', necesario para la formación del enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido. Por lo tanto la incorporación de un ddNTP implica la terminación de la cadena.
En este método de secuenciación podemos distinguir 3 fases: síntesis enzimática, separación y análisis de los fragmentos y automatización.
- Síntesis de un ADN complementario de longitud variable.
Se parte de una hebra sencilla del ADN que se quiere secuenciar. Se añade un cebador, marcado radiactivamente, que hibride con el extremo 3' de la zona que se quiere secuenciar.
Esta mezcla se coloca en 4 tubos de ensayo, a cada uno de ellos se le añaden los 4 tipos de nucleótidos (dNTPs) necesarios para la síntesis de la nueva hebra de ADN. Además a cada tubo se añade uno solo de los didesoxirribonucleótidos (ddNTP) terminadores de cadena, en una proporción* bien definida entre éste y el desoxirribonucleótido correspondiente.
Al añadir a los tubos la ADN polimerasa, comienza la polimerización a partir del cebador, pero cesa al incorporarse un ddNTP. Por ejemplo en el tubo 1, existe ddATP que se incorporará a las cadenas que se están sintetizando, y las bloqueará. En consecuencia, todas las cadenas nuevas contenidas en este tubo, comenzarán con el cebador en 5' y terminarán en 3' con el mismo nucleótido, en este caso el ddATP. De igual manera, en el tubo 2 (ddTTP) las cadenas terminarán aleatoriamente en G, el tubo 3 lo harán en C y en el 4, en G.
* Se usa una cantidad baja de ddNTP, de esta manera se consigue que la interrupción de la síntesis por la incorporación del didesoxirribonucleótido tenga lugar no inmediatamente sino a una cierta distancia, variable aleatoriamente, del cebador.
- Separación de los fragmentos y análisis.
A continuación, el ADN de cada tubo se desnaturaliza, para liberar así la cadena recién sintetizada, que además será radiactiva, ya que se han utilizado nucleótidos marcados radiactivamente.
Las muestras de cada tubo son depositadas en un gel de poliacrilamida para separar los fragmentos en función de su tamaño (mediante electroforesis) y, finalmente las posiciones de las bandas son reveladas por autorradiografía. La sucesión de bandas de cada una de las 4 reacciones, comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN.
Al examinar la secuencia de la figura puede verse que el primer nucleótido añadido es G, el segundo sería C, ...
- Automatización.

Han ido surgiendo distintas variantes del método inicial de Sanger, en lo referente al tipo y lugar de marcaje de los nucleótidos, especialmente el aparecer los fluorocromos como alternativa a los isótopos radiactivos.
El usar un fluorocromo distinto en cada una de las cuatro reacciones de síntesis permite automatizar el método, de forma que "lean" simultáneamente las hebras marcadas de las cuatro mezclas.




ACTIVIDADES

1.- ¿Qué es la clonación génica?
2.- ¿Qué función tienen las endonucleasas de restricción? ¿Qué utilidades se derivan de la misma?
3.- Dada la secuencia de ADN siguiente:
...A T G C G A A T T C C C G C C A G G T T A T G C A A T T C A T G...

...T A C G C T T A A G G G C G C T C C A A T A C G T T A A G T A C...

¿Cuántos y cuáles serían los fragmentos que originaría si se corta con la restrictasa EcoRI?
4.- Dado el siguiente fragmento de ARNm:
...U U A C G U U A A G C U A U A G...

1. 
   ¿Cuál sería el ADN formado por retrotranscripción o ADN complementario (ADNc)?
   
2. 
   ¿Sería cortado por la restrictasa EcoRI? En caso afirmativo indica que fragmentos originaría ?
   

5.- ¿Qué entiendes por ADN recombinante?
6.- ¿Qué es un vector en Ingeniería Genética? ¿Cuáles son los principales vectores empleados?
7.- ¿Por qué se utiliza la transcriptasa inversa para introducir genes de células eucariotas en células procariotas?
8.- Las reacciones de secuenciación de un fragmento de ADN según el método de Sanger son las que se indican en el dibujo
Realiza la secuenciación del fragmento en cuestión

9.- ¿Por qué al situarse un didesoxinucleótido en la cadena de replicación se paraliza la actividad de la ADN-polimerasa?

ACTIVIDADES P.A.U.
10.- Defina el concepto de biotecnología y describa una aplicación de la misma en la que intervengan bacterias. (Opción A)

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Biología. Biotecnología