Resumen las plantas están constantemente expuestas a condiciones adversas que afectan su desarrollo. En muchos casos condiciones extremas tales como exceso de radiación uv-b,
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| Respuestas De Plantas Al Exceso De Radiacion Uv-B. Busqueda De Moleculas Antioxidantes Plant Responses To Excess Of Uv-B Radiation. Searching For Antioxidants Molecules Gustavo E. Zúñiga[13] 13 Laboratorio de Fisiología y Biotecnología Vegetal, Facultad de Química y Biología. Universidad de Santiago de Chile. E-mail: gustavo.zuniga@usach.cl. Code Number: cp09019 RESUMEN Las plantas están constantemente expuestas a condiciones adversas que afectan su desarrollo. En muchos casos condiciones extremas tales como exceso de radiación UV-B, sequia, salinidad y temperaturas extremas inducen la acumulación de especies reactivas de oxigeno (EROs), que afectan macromoléculas y estructuras celulares. La caracterización de los mecanismos empleados por especies de ambientes extremos en la tolerancia al ambiente representa una herramienta interesante en la búsqueda de moléculas. Deschampasia antarctica y Colobathus quitensis, son las únicas plantas vasculares nativas del continente antártico, situación que se debe entre otros factores a las condiciones extremas del continente. En su hábitat estas plantas están expuestas a bajas temperaturas, altos niveles de radiación ultravioleta y déficit hídrico, exceso de sales entre otros factores. Sin embargo, a pesar de estas condiciones existen poblaciones de estas plantas que se desarrollan naturalmente. Para el caso de las especies antárticas existen reportes que muestras que D. antarctica y C. quitensis han experimentado un crecimiento significativo. Nuestro grupo realiza desde hace algunos años estudios a nivel de campo y de laboratorio orientados a identificar los mecanismos responsables de la tolerancia de estas plantas al ambiente. En este trabajo presentaremos resultados obtenidos en estudios realizados en condiciones naturales y condiciones de laboratorio. Palabras claves: Antartica, Deschampsia antarctica, Colobanthus quitensis, Haplopappus bailahuen, espécies reactivas de oxigeno, antioxidantes. ABSTRACT Plants are constantly exposed to adverse conditions affecting their development. In many cases, extreme conditions such as excessive UV-B radiation, drought, salinity and extreme temperatures induce the accumulation of reactive oxygen species (ROS), affecting macromolecular and cellular structures. The characterization of the mechanisms used by species of extreme environments on tolerance to the environment represents an interesting tool in the search for molecules. Colobathus quitensis and Deschampasia antarctica are the only vascular plants native to the Antarctic continent, due to the extreme conditions of the continent, among other factors. In their habitat, these plants are exposed to low temperatures, high levels of ultraviolet radiation and water deficit, excess of salts and other factors. However, despite these conditions there are populations of these plants growing naturally. In the case of Antarctic species, there are reports showing that D. antarctica and C. quitensis have experienced a significant growth. From several years, our group performs field and laboratory studies aimed at identifying the mechanisms responsible for the tolerance of these plants to the environment. In this paper we present results obtained from studies in natural conditions and laboratory conditions. Keywords: Antarctic, Deschampsia antarctica, Colobanthus quitensis, Haplopappus bailahuen, reactive oxygen species, antioxidants. INTRODUCCION En plantas un amplio rango de factores abióticos puede inducir estrés oxidativo. El exceso de sales, la sequia y el estrés oxidativo son acompañados por la formación de especies reactivas de oxigeno tales como el anion superóxido (O2-), peróxido de hidrogeno H2O2 y el ion hidroxilo (OH-), que pueden dañar membrana y macromoléculas (Asada 1999; Mittler, 2002; Noctor e Foyer, 1998). En células aeróbicas se han desarrollado una serie de sistemas antioxidantes para controlar el efecto nocivo de las EROs. Las plantas presentan sistemas antioxidantes que incluyen componentes enzimáticos y no enzimáticos. Por ejemplo, pueden emplear una serie de arreglos enzimáticos tales superoxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y peroxidases, así como también antioxidantes no enzimáticos de bajo peso molecular tales como el glutatión, ascorbato, compuestos fenólicos y lignanos que les permiten atrapar diferentes tipos de EROs (Foyer et al., 1994; Pietta, 2000). Deschampasia antarctica y Colobathus quitensis son las únicas plantas vasculares nativas del continente antártico. En su hábitat las plantas están expuestas a bajas temperaturas, altos niveles de radiación ultravioleta y déficit hídrico, todas condiciones que inducen estrés ((Mittler, 2002). Sin embargo, a pesar de estas condiciones existen diversos reportes que señalan que las poblaciones de ambas plantas han experimentado un crecimiento significativo (Day et al., 1999). Nuestro grupo realiza desde hace algunos años estudios a nivel de campo y de laboratorio orientados a identificar los mecanismos responsables de la tolerancia de estas plantas al ambiente (Zúñiga et al., 1994). En este trabajo presentaremos resultados obtenidos en estudios realizados en condiciones naturales y condiciones de laboratorio. MATERIAL Y MÉTODOS En condiciones naturales (Islas Robert y Rey Jorge, Shetland del Sur,), se registraron variables microclimáticas tales como temperatura del aire, humedad relativa del aire, radiación PAR y radiación UV-B, en una micropoblación de D. antartica. A estas plantas se les determinó los niveles de peróxido de hidrogeno, lipoperoxidación de membranas (Pinhero et al., 1997), y respuestas antioxidantes. La medición de las variables microclimáticas temperatura, radiación fotosintéticamente activa (PAR), humedad relativa del aire y radiación UV-B, fueron registradas empleando una estación Datta Loger. Liperoxidación de membranas La lipoperoxidación de membranas fue estimada midiendo la concentración de malondialdehido (MDA) a través del ensayo de acido tiobarbiturico (TBA) (Ederli et al. 1997). 0.1 g de hojas se homogenizan con 2 mL de TCA (1%) y centrifugada a 10.000 g por 5 minutes. Se mezclaron 250 μL del sobrenadante con 1 mL of TBA (0.5%) en TCA (20%). Las mezclas se incubaron in agua hirviendo durante 30 minutos, y luego enfriadas a temperatura ambiente. Se determino la absorbancia a 532 nm y la absorbancia no especifica a 600 nm (Hodges et al., 1999). El contenido de MDA se determine usando el coeficiente de extinción molar igual a 155 mol-1 cm-1. Contenido peróxido de hidrogeno El contenido de peróxido de hidrogeno fue determinado mediante el método reflectométrico usando un equipo Rqflex (Merck), con un rango de sensibilidad entre 0.2-20 mg L-1, se maceraron 0,1 g de tejido fresco en 2 mL de buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7 e inmediatamente usado para el análisis. Respuestas antioxidantes enzimáticas Actividad ascorbato peroxidasa (APX) La actividad APX (EC 1.11.1.11) fue determinada midiendo la descomposición de ascorbato a 290 nm durante un lapso de 45 sg. La mezcla de reacción contenía 1 mL de buffer fosfato 50 mM (pH 7.0), 5 μl de H2O2 30%, 40 μl de 10 mM ácido ascórbico 10 mM y 20 μl de sobrenadante enzimático. La actividad enzimática fue calculada usando el coeficiente de extinción molar de 2.8 mM-1 cm-1 (Zhao e Blumwald, 1998). Actividad catalasa (CAT) La actividad CAT (EC 1.11.1.6) fue determinada midiendo la descomposición de peróxido de hidrogeno a 240 nm durante 45 sg. La mezcla de reacción contenía 1 mL de buffer fosfato 50 mM (pH 7.0), 3 μL de H2O2 30% y 20 μL de sobrenadante enzimático. La actividad enzimática fue determinada usando como coeficiente de extinción molar 39.4 mM-1 cm-1 (Pinhero et al., 1997). Actividad peroxidasa total (POX) La actividad POX (EC 1.11.1.7) fue determinada midiendo la aparición de tetraguiacol a 470 nm durante 45 sg. La mezcla de reacción contenía 1 mL de buffer fosfato 50 mM (pH 7.0), 5 μL de H2O2 30%, 5 μL de guaiacol y 10 μL de sobrenadante enzimático. La actividad enzimática fue calculada usando como coeficiente de extinción molar 26.6 mM-1 cm-1 (Pinhero et al., 1997). Respuestas antioxidantes no-enzimáticas Preparación de extractos Los extractos fueron preparados tomando 100 mg de tejido y extraídos en 3 mL de 100 metanol. Los extractos fueron sonicados a 50/60 Hz (Cole-Parmer, Model 8851) por 4 h, y mantenidos a 4 °C por 96 h en oscuridad hasta su análisis. Determinación del contenido de fenoles totales El contenido de fenoles totales fue determinado empleando el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu colorimetric (Asami et al., 2003). Los valores son expresados en mg equivalentes de acido gálico. Capacidad antioxidante La capacidad antioxidante de los extractos metanolicos fue determinada midiendo el consumo del radical estable 1,1-Difenil-2-Picril-Hidrazil (DPPH). La solución de DPPH es (λ max = 517 nm), pero se decolora cuando reacciona con moléculas antioxidantes (Blois, 1958). La determinación se realiza midiendo el consumo de DPPH en un lapso de 180 sec, al mezclar 50 μL de extracto con 950 μL of solución de DPPH (Brand-Williams et al., 1995). Cultivo in vitro de especies extremofilas Para disponer de material suficiente para realizar trabajos en condiciones de laboratorio, hemos implementado la técnica del cultivo de tejidos in vitro como herramienta biotecnología. En estas condiciones hemos iniciado estudios orientados a caracterizar algunos de los mecanismos involucrados en la tolerancia de D. antárctica, C. quitensis al ambiente usando el medio descrito por Murashige y Skoog (1962). RESULTADOS Y DISCUSION La radiación PAR y la radiación UV-B experimentan cambios significativos durante el verano antártico, alcanzando valores que puede provocar condiciones de estrés en plantas (Figura 1). Sin embargo, en estas condiciones D. antarctica muestra una eficiencia fotosintética normal, lo que le permite acumular durante el verano altos niveles de azucares solubles, sacarosa, rafinosa y fructanos. Esta condición permite que D. antarctica sea una planta altamente tolerante al congelamiento. Nuestros resultados muestran que D.antarctica, es altamente tolerante a la radiación UV-B, pues bajo ninguna de las condiciones de análisis presentó síntomas de estrés oxidativo. Los niveles de lipoperoxidos (MDA) y peróxido de hidrogeno no sufren cambios significativos durante un ciclo diario, a pesar que los niveles de radiación UV-B varían drásticamente (Figura 2). Esta capacidad de tolerar el estrés oxidativo inducido por el ambiente, se correlacionó con una alta actividad de los sistemas antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos). A nivel no-enzimático, las plantas acumulan altos niveles de compuestos que absorben radiación ultravioleta (Fig. 3). Estos compuestos presentan además, una alta capacidad atrapadora de radicales libres (Fig. 4). Para disponer de material suficiente para empleado en análisis moleculares y genéticos, se implemento la técnica del cultivo de tejidos in vitro en D. antarctica y C. quitensis (Figura 5). Los cultivos in vitro de D. antartica y C. quitensis (Zúñiga et al., 2009) se han se han utilizado en la determinación de los efectos del déficit hídrico y exceso de sales. Los resultados muestran que plantas sometidas a 7,5% de PEG-8000 no muestran síntomas de daño. En el caso de C. quitensis, esta situación se correlaciona con la acumulación de altos niveles de glicina-betaina, mientras que en D. antartica con una acumulación de principios antioxidantes. Frente al estrés salino las plantas de D. antartica acumulan compuestos derivados de la ruta fenilpropanoide, varios de los cuales presentan propiedades biológicas de interés. Por esta razón, hemos realizado un trabajo orientado a aislar y caracterizar algunos de los genes claves de esta vía, tales como fenilalanina amonioliasa (PAL), charcona sintasa (CHS), charcona isomerasa (CHI) y flavonol 3-hidroxilasa (F3H) y dehidroflavonol 4-reductasa (DFR), que resultan interesante desde un punto de vista biotecnológico. Los patrones de expresión de estos genes, responden a variaciones en las condiciones microambientales en forma diferencial. En conclusión, D.antarctica y C. quitensis constituyen un reservorio de moléculas con propiedades biológicas muy interesantes. La identificación de los genes responsables de tales moléculas, contribuirá el desarrollo de la biotecnología de especies antárticas. REFERENCIAS
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