Conocer la estructura de la hemoglobina con sus diferentes funciones




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fecha de publicación01.02.2016
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HEMOGLOBINA

OBJETIVO:

  • Conocer la estructura de la hemoglobina con sus diferentes funciones.

  • Determinar la concentración de Hemoglobina presente en los glóbulos rojos utilizando la técnica de Cianometahemoglobina.

  • Permitir al estudiante una interpretación clínica según los resultados obtenidos para un adecuado diagnostico de las patologías en animales.

MARCO TEORICO:

La hemoglobina (Hb) es una heteroproteína globular de la sangre, de peso molecular 64.000 (64 kD), presentes en los hematíes en altas concentraciones, que fijan oxígeno en los pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos y células que rodean el lecho capilar del sistema vascular. Al volver a los pulmones, desde la red de capilares, la hemoglobina actúa como transportador de CO2 y de protones.

Cuando la hemoglobina está unida al oxígeno, se denomina oxihemoglobina o hemoglobina oxigenada, dando el aspecto rojo o escarlata intenso característico de la sangre arterial. Cuando pierde el oxígeno, se denomina hemoglobina reducida, y presenta el color rojo oscuro o bordó de la sangre venosa (se manifiesta clínicamente por cianosis).



La forman cuatro cadenas polipeptídicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo, cuyo átomo de hierro es capaz de unirse de forma reversible al oxígeno. El grupo hemo se forma por:



  1. Unión de la Succinil CoA (formado en ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico) a un aminoácido glicina formando un grupo pirrol.

  2. Cuatro grupos pirrol se unen formando la Protoporfirina IX.

  3. La protoporfirina IX se une a una molécula de hierro ferroso (Fe2+) formando el grupo hemo. Finalmente cada molécula Hem se combina con una larga cadena polipéptica, llamada globina, sintetizada por los ribosomas, formando una subunidad hemoglobina llamada cadena de hemoglobina. Cada una de estas cadenas tiene un peso molecular de aproximadamente de 16000 Kd; se unen cuatro de ellas de forma laxa para formar la molécula completa de hemoglobina.

SuccinilCoA+Glicina Pirrol

4 Pirrol Protoporfirina IX + Fe2+ Vit B6 Grupo Hem + Globina
( polipéptidos – cadenas , B, ,D) subunidad Hemoglobina (16000Kd)

4 subunidades de Hemoglobina (16000Kd) 1molécula de Hemoglobina (Hb)
Existen diferentes ligeras variaciones en distintas subunidades de las cadenas de hemoglobina, dependiendo de la composición en aminoácidos de la porción

polipeptídica. Los diferentes tipos de cadenas se denominan cadenas alfa, cadenas beta, cadenas gamma y cadenas delta. La forma más frecuente de hemoglobina es la A, es una combinación de dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Debido a que cada cadena tiene un grupo protéico hem, hay 4 átomos de hierro encada molécula de hemoglobina; cada una de ellas puede unirse a una molécula de oxígeno, siendo pues un total de 4 moléculas de oxígeno las que pueden transportar cada molécula de hemoglobina.
Propiedades funcionales de la hemoglobina como transportador de oxígeno:

  • La afinidad por el oxígeno de la hemoglobina es tal que la hemoglobina se sutura por completo con oxígeno en los pulmones expuesto al aire atmosférico y entrega oxígeno a la presión parcial de oxígeno que encuentra en los tejidos. Se puede comparar la afinidad por el oxígeno de diferentes hemoglobinas o diferentes eritrocitos determinando la presión parcial de oxígeno a los cuales es oxigenada la mitad de la hemoglobina y la mitad de deoxigenasa, es decir, la P50.

  • La unión inicial del oxígeno con la hemoglobina facilita la unión siguiente del oxígeno con la hemoglobina. Esta característica se denomina interacción hemo-hemo, porque la unión de un hemo afecta las propiedades de unión de otros hemos. La cambiante afinidad por el oxígeno de la hemoglobina con la oxigenación produce una curva sigmoidea cuando se diagrama el grado de oxigenación o porcentaje de saturación con oxígeno de la hemoglobina contra la presión parcial de oxígeno. La gran afinidad por el oxígeno de la mioglobina a la presión de oxígeno normal en los tejidos permite que la hemoglobina actúe como una proteína de acumulación de oxígeno del músculo, que lo libera a la presión parcial intracelular de oxígeno muy baja que se produce como consecuencia del ejercicio.

  • La afinidad por el oxígeno de la hemoglobina cambia con el pH intracelular. En los capilares de los tejidos en actividad metabólica el CO2, entra en el plasma y los eritrocitos. Estos contienen anhidrasa carbónica que rápidamente convierte el CO2 al H2CO3, un ácido débil que se ioniza a H y HCO3, haciendo descender el pH intracelular. Este aumento de la concentración del ión hidrógeno reduce la afinidad del oxígeno por la hemoglobina (efecto Bohr) y facilita la entrega de oxígeno a los tejidos. A medida que se acumula en el eritrocito desoixhemoglobina, un ácido más débil que la oxihemoglobina y que por lo mismo puede fijar los protones que se agregan, la desoxihemoglobina se une a los iones H liberado del H2CO3. La mayor cantidad de iones HCO3 se difunden hacia el exterior del eritrocito y son remplazados por iones cloruro en la llamada ‘desviación cloruro’. En los pulmones el proceso se invierte; la sangre se desprende de CO2, se eleva el pH y aumenta la afinidad por el oxígeno de la hemoglobina.

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA:

Al mezclar la sangre con el reactivo de DRABKIN, se transforma la hemoglobina en cianmetahemoglobina, la intensidad de color de esta reacción es medida en un fotocolorímetro o espectofotómetro.

La reacción se da así: El reactivo de Drabkin contiene cianuro potásico y ferricianuro potásico. El ferricianuro hace pasar el hierro de la hemoglobina del estado ferroso (Fe++) al férrico (Fe+++) para formar metahemoglobina, la cual se combina con cianuro potásico y da un pigmento estable, la cianmetahemoglobina.

La intensidad del color se mide mediante un fotómetro a una longitud de onda de 540 nm. La densidad óptica de la solución es proporcional a la concentración de hemoglobina.

MATERIALES


  • Solución de Drabkin: Potasio ferricianuro 0.6mM

          • Potasio cianuro 0.7mM

          • Buffer y estabilizantes

  • Patrón de la hemoglobina

  • Espectofotometro Abs. 540nm

  • Celdas

  • Pipeta automática o micropipeta

  • Puntas

  • Tubos de ensayo

  • Gradilla

  • Cronometro

  • Muestra: Sangre anticoagulada con aditivos como EDTA, Citrato y Oxalato.



PROCEDIMIENTO


  • Prender el fotocolorímetro o el espectofotómetro y esperar a que alcance la temperatura adecuada para su funcionamiento.



  • Tome 3 tubos de ensayo:

    • En el primer tubo adicione únicamente 5ml del reactivo

    • En el segundo tubo adiciones 5ml del reactivo mas 0.02 ( 20ul)de la muestra

    • En el tercer tubo adicione 5ml del reactivo mas 0.02 ml ( 20ul)del patrón de Hb ( Hemoglobina) .




BLANCO

MUESTRA

PATRON

REACTIVO HEMOGLOBINA

5 mL

5 mL

5mL

SANGRE TOTAL

----

0.02 mL

----

PATRON

----

----

0.02 mL




  • Con papel absorbente eliminar el exceso de sangre que queda en las paredes externas de la pipeta antes de introducirla en la solución de Drabkin.





Reactivo blanco – muestra – patrón muestra patrón

Drabkin


  • Llevar la pipeta hasta el fondo del tubo y depositar la sangre, procurando lavar las paredes internas de la pipeta; esto se logra mediante aspiraciones y expulsiones consecutivas de reactivo dentro del tubo.

  • Evitar la formación de burbujas.

  • Tapar el tubo y mezclar 5 veces por inversión.

  • Dejar reposar por 10 minutos para que se produzca la hemólisis total de las células rojas y se complete la reacción.

  • Realizar el mismo procedimiento para el patrón.

  • Transferir la solución a las cubetas del fotocolorímetro.



  • Leer la solución obtenida, usar como blanco el reactivo de Drabkin.
    Calcular la concentración de hemoglobina, utilizando la curva de calibración o multiplicando por una constante que resulta de la calibración del método.






´

VALORES DE REFERENCIA



CAUSAS DE ERROR

  • La estasis prolongada, origina resultados falsamente elevados de hemoglobina en las muestras de sangre venosa.

  • La muestra no se mezcla adecuadamente.

  • Temperaturas de almacenamiento y transporte inadecuado.

  • Errores de pipeteo o de dilución.

  • Muestra de sangre con coagulo.

  • Sangre lipemia (alto contenido de grasas o lípidos)



CONSULTA: Explicar las deficiencias de la HEMOGLOBINA y sus posibles causas.

BIBLIOGRAFIA


  • Drabkin, D.L, Agustin, J.H, Biol Chem, 1935. Hemoglobina solución Drabkin método cianometahemoglobina

  • Gonzáles V.E, 2005. Determinación de la hemoglobina

  • M.G. Davidson, R.W. Else, J.H. Lumsden (Eds.), "Manual de Patología Clínica en Pequeños Animales", Editorial Harcourt.


HEMATOCRITO
OBJETIVOS:


  • Determinar el volumen del paquete celular o volumen que ocupan los glóbulos rojos en la sangre.

  • Permitir al estudiante una interpretación clínica con los resultados obtenidos concluyendo así el diagnostico de diferentes patologías


MARCO TEORICO:
Hematocrito (Hto) o volumen globular agregado o Volumen de Paquete Celular

(VGA, o VPC), permite la determinación del volumen que ocupan los eritrocitos en la sangre, se expresa en porcentaje (unidades convencionales) o L/L (sistema internacional de unidades). Un VGA de 43% (0,43 L/L) indica que los eritrocitos ocupan el 43% del volumen total sanguíneo, es un parámetro que varia de acuerdo al sexo y puede verse afectado por la altitud sobre el nivel del mar.

Esta prueba quiere decir literalmente separación de la sangre; esta ideada para

separar la sangre en un tubo en tres capas, mediante centrifugación. Las partículas más pesadas, los glóbulos rojos, se depositan en el fondo, los leucocitos y las plaquetas forman una capa sobre ellos (llamada “buffy coat”) y la capa superior esta formada por el plasma. Es esta una prueba sencilla de realizar y proporciona muchos datos con gran rapidez. Debe realizarse dentro de las 5 horas siguientes a la toma de la sangre, preferiblemente menos. La información que se obtiene con frecuencia del Hematocrito es la altura relativa de la capa de los glóbulos rojos que indica el porcentaje de sangre ocupado por los hematíes.

El hematocrito se expresa de acuerdo con la nomenclatura tradicional como porcentaje, o preferiblemente, de acuerdo al Sistema Internacional (SI) de unidades como fracción decimal (L/L).



FUNDAMENTO:

Conocido como microhematocrito o Hematocrito capilar. Se determina aplicando una fuerza centrífuga de 8.000 a 12.000 r.p.m por 5 minutos, determinando así el volumen que ocupan los eritrocitos en la sangre o paquete celular.

MATERIALES

  • Sangre total anticoagulada con EDTA o sangre capilar.

  • Tubos capilares de vidrio desechables de 1 mm de diámetro interior y 0.75 cm de longitud.

  • Plastilina.

  • Centrífuga para microhematocrito

  • Tabla de lectura

PROCEDIMIENTO

  • Mezclar cuidadosamente la sangre por un minuto.

  • Se sumerge el capilar en el tubo de sangre con anticoagulante

  • Dejar llenar por capilaridad 2/3 del capilar con la muestra evitando la formación de burbujas.

  • Sellar uno de los extremos del capilar con plastilina.

  • Colocar los capilares del hematocrito en los surcos radiales del accesorio apropiado de la centrífuga, en posición opuesta el uno al otro, y con su extremo sellado en la parte exterior.

  • Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos.

  • Extraer los tubos tan pronto la centrífuga se detenga. Efectuar la lectura de los capilares.





VALORES DE REFERENCIA

Bovino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

25-45

Hemoglobina

g/l

8 - 13

Globulos rojos

**

5.0-10.0

Leucocitos

***

4 - 12

Neutrófilos

%

15 - 40

Abs.

0,6 - 4

Linfocitos

%

45 - 75

Abs.

2,5 - 7,5

Monocitos

%

1 - 5

Abs.

0,03 - ,8

Eosinófilos

%

2 - 10

Abs.

0 - 2,4

Basófilos

%

0 - 1

Abs.

<0,2

Bandas

%

0 - 1

Abs.

0 - 0,12

Plaquetas

***

110 - 800




Canino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

37 - 52

Hemoglobina

g/l

12 - 18

Globulos rojos

**

5.4-7.8

Leucocitos

***

6 - 17

Neutrófilos

%

55 - 76

Abs.

3 - 11,5

Linfocitos

%

15 - 30

Abs.

1 - 4,8

Monocitos

%

1 - 5.0

Abs.

0,15 - 1,35

Eosinófilos

%

2 - 12

Abs.

0,1 - 1,25

Basófilos

%

0 - 1

Abs.

<0,1

Bandas

%

0 - 3

Abs.

0 - 0,3

Plaquetas

***

200 - 500




Equino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

32-55

Hemoglobina

g/l

10 - 18

Globulos rojos

**

6.4-10.0

Leucocitos

***

5.2 - 13,9

Neutrófilos

%

30 - 60

Abs.

2,2 - 7,4

Linfocitos

%

25 - 60

Abs.

1,1 - 5,3

Monocitos

%

1 - 5

Abs.

0 - 0,9

Eosinófilos

%

2 - 10

Abs.

0-0,6

Basófilos

%

0 - 1

Abs.

<0,3

Bandas

%

<1

Abs.

0 - 0,1

Plaquetas

***

100-600




Felino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

26-45

Hemoglobina

g/l

8 - 14

Globulos rojos

**

5.8-10.7

Leucocitos

***

5.5 - 19,5

Neutrófilos

%

35 - 75

Abs.

2,5 - 12,5

Linfocitos

%

15-35

Abs.

1,5 - 7

Monocitos

%

0 - 4

Abs.

0 - 0,85

Eosinófilos

%

2 - 12

Abs.

0 - 1,5

Basófilos

%

0 - 1

Abs.

<0,1

Bandas

%

0 - 1

Abs.

0 - 0,3

Plaquetas

***

200 - 600



Porcino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

32-50

Hemoglobina

g/l

10 - 16

Globulos rojos

**

5.0-8.0

Leucocitos

***

10 - 22

Neutrófilos

%

30-50

Abs.

3,2 - 10

Linfocitos

%

40-60

Abs.

4,4 - 13,5

Monocitos

%

2 - 7

Abs.

0,2 - 2,2

Eosinófilos

%

2 - 7

Abs.

0,2 - 2

Basófilos

%

0-2

Abs.

Raro

Bandas

%

1 - 3

Abs.

 

Plaquetas

***

250-600



Ovino

Parámetros

Uds.

Valores

Hematocrito

 

24-50

Hemoglobina

g/l

8 - 16

Globulos rojos

**

8.0-15.0

Leucocitos

***

4 - 12

Neutrófilos

%

20-40

Abs.

1 - 5

Linfocitos

%

40-75

Abs.

2 - 9

Monocitos

%

1 - 4

Abs.

0 - 0,75

Eosinófilos

%

2 - 10

Abs.

0,1 - 0,75

Basófilos

%

0-1

Abs.

Raro

Bandas

%

0-1

Abs.

 

Plaquetas

***

220-660



**Glóbulos Rojos

Sistema antiguo: células/mm3 (l)= x106 Sistema nuevo: células/ l = x 1012



***Para Leucocitos y Plaquetas

Sistema antiguo: células/ mm3 (l)= x103 Sistema nuevo: células/ l = x 109



Criterios Generales para la Interpretación de los Glóbulos Blancos

 

 

Canino

Felino

Equino

Bovino

Relación:Neutrófilos / Linfocitos




3,5:1

1,8:1

1,1:1

0,5:1

Leucopenia v 103

 

<6

<8

<7

<4

Leucocitosis

moderada

18 - 30

20 - 30

15 - 25

12.0 - 15.0

marcada

30 - 50

30 - 50

25 - 30

15 - 25

extrema

50 - 100

50 - 75

>35

>25

Sistema antiguo: células/ mm3 (l)= x103
Sistema nuevo: células/ l = x 109



OBSERVACIONES


  • Si el tubo del hematocrito es sellado de forma incompleta, el resultado será erróneo y anormalmente bajo ya que al girar los tubos en la centrífuga, se produce una pérdida de eritrocitos que es mayor que la pérdida del plasma.

  • Si los tubos son centrifugados de forma inadecuada, o permanecen demasiado tiempo en el interior de la centrífuga parada, los resultados serán así mismo erróneos por dar demasiado elevados.

  • El tiempo y la velocidad de la centrifugación son factores muy importantes que deben tenerse en cuenta para obtener el máximo agrupamiento de los glóbulos rojos.

  • Si la sangre posee demasiado anticoagulante, la lectura de hematocrito será anormalmente baja debido al encogimiento (contracción) de los glóbulos rojos.



BIBLIOGRAFIA:

  • Feldman, Zinkl y Jain. Schalm's Veterinary Hematology.

  • Meyer y Harvey. Veterinary Laboratory Medicine.

  • Benjamin, Maxime. Outline of Veterinary Clinical Pathology

  • http://www.lmvltda.com/index.php?section=48





GLOBULOS BLANCOS

OBJETIVO:


  • Diferenciar morfológicamente los glóbulos blancos en base a su estructura y función

  • Realizar el recuento de los glóbulos blancos y su diferencial de acuerdo a su morfología.

  • Interpretación clínica de los resultados obtenidos



MARCO TEORICO
Los leucocitos (también llamados glóbulos blancos) son un conjunto heterogéneo de células sanguíneas que son los efectores celulares de la respuesta inmune, así intervienen en la defensa del organismo contra sustancias extrañas o agentes infecciosos (antígenos).


Según las características microscópicas de su citoplasma (tintoriales) y su núcleo (morfología), se dividen en:
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