Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer de una serie de medios de cultivo estériles
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| MEDIOS DE CULTIVO Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer de una serie de medios de cultivo estériles. Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar, es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentación). Preparación de medios de cultivo: Caldo común. Composición por litro. Extracto de carne 3 g Peptona bacteriológica 10 g Cloruro sódico 5 g Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado directamente) y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50 y 75 ml. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos. Agar nutritivo. La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización. Cuando aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y se extiende en placas (a 45ºC) y en tubos, que seguidamente son inclinados para obtener una superficie más extensa. Medio base para la fermentación de azúcares. Inicialmente se prepara un medio base pobre en aminoácidos de la siguiente composición por litro: Extracto de carne 1 g Peptona bacteriológica 10 g Cloruro sódico 5 g Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se añaden 2 ml de solución de púrpura de bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se disuelve inicialmente en etanol al 95 y posteriormente se diluye con agua) por litro. Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo de pH 5.2, por lo que permite la detección de la producción de ácido en el medio. El medio se reparte en tres volúmenes iguales a los que se añade 10 g por litro de glucosa, lactosa (Gal-Glu) o sacarosa (Glu-Fru). Una vez disuelto, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 7 ml/tubo, en el que previamente se ha introducido una campana Durham, pequeño tubo de ensayo que se dispone en posición invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar completamente el interior de estas campanas para poder detectar posteriormente el desprendimiento de gases en la fermentación. (No olvidar marcar cada tubo con la inicial del azúcar que contenga). Una vez taponados, se esterilizan a 0.5 atm de sobrepresión durante 20 min. El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su reconstitución. Las principales características a destacar de su composición son: Agar de McConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram positivas. Agar al verde brillante (AVB). Contiene lactosa, sacarosa, una elevada concentración de aminoácidos, verde brillante como inhibidor de crecimiento de muchos fermentadores, y rojo de fenol como indicador de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminoácidos y generan color rosa. Los fermentativos o no crecen o dan color amarillo. Agar de tres azúcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa, citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos inclinados pero de mucho volumen. Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica. Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Se trata de un medio rico lactosado con dos colorantes, eosina y azul de metileno, que también funcionan como inhibidores del crecimiento de Gram positivos. En este medio E.coli crece como colonias negras con brillo verde metálico. Caldo de urea-Indol. Es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la actividad ureasa y la producción de indol a partir de triptófano. En estas prácticas se empleará sólamente para determinar la presencia de actividad ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguinte alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol desdee el verde original al azul intenso. Si se quisiera determinar la producción de indol bastaría añadir al medio tras la incubación 0.3 ml el reactivo de Kovacs (reactivo IND del ensayo API), siendo positiva si se produce cambio de color al rojo.. Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de un medio natural muy rico que contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema comercial para la eliminación del oxígeno. Agar Nutritivo (AN) Extracto de levadura 2 g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l pH 7,4 AGAR MUELLER-HINTON – Marcar como MH - Infusión de carne..........................................5,0 g. - Caseina hidrolizada.....................................17,5 g. - Almidón........................................................1,5 g. - Agar............................................................12,5 g. - pH = 7,4 ± 0,2 a) Tinción de Gram. De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. 9 Procedimiento 1. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus). 2. Fijación. 3. Cristal violeta 1-2 minutos. 4. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!). 5. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!) 6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos) 7. Lavar con agua. 8. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. 9. Lavar con agua. 10. Secar. 11. Observar (100×). ANTIBIÓTICOS Introducción Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. Se caracterizan por: -Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas). -Son efectivos a bajas concentraciones. -Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador. -Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. -Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro. -Solubles en agua. -Poseen estabilidad química. -Son productos del metabolismo secundario. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección. Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas (Bacillus, Streptomyces, Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium) Se pueden clasificar según: Su origen •Naturales: sintetizados por microorganismos. •Sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química. •Semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente. Su estructura química •ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas. •Macrólidos: eritromicina. •Aminoglucósidos: estreptomicina. •Polipeptídicos: bacitracina. •Poliénicos: anfotericina B •Tetraciclinas •Derivados del benceno: cloranfenicol. Su mecanismo de acción •Actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas. •Actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. •Inhiben la síntesis proteica. •Inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina. 17 Objetivos 1. Detectar la producción de antibiótico por microorganismos 2. Valorar la cantidad de antibiótico presente en una solución 3. Determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo frente a un organismo (“antibiograma”). Materiales Tubos con 20 ml de AN y YED fundido, baño a 50ºC, placas Petri, mecheros, pipetas pasteur, pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G 25, 50, 100 μg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 10 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml; microorganismos: Streptomyces, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis. Procedimiento 1. PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce algún antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se emplearán dos posibles microorganismos productores del género Streptomyces y un microorganismo sensible (Saccharomyces cerevisiae). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50ºC en un baño a dicha temperatura. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar, cada uno con uno de los microorganismos a ensayar. 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. 2. VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con el efecto de cantidades conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible, Bacillus subtilis. Esta técnica se emplea en los procesos de mejora de la producción de un 18 determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del mismo antibiótico. Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 15 minutos) colocar con ayuda de pinzas cuatro discos de papel saturados con la correspondiente solución de antibiótico. 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los diámetros con una regla, hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3 periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida. 3. “ANTIBIOGRAMA” El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía. 4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20 minutos) colocar con ayuda de pinzas tres discos de papel saturados con la correspondiente solución de los diferentes antibióticos: Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). 5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico. 6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño. Indicar qué antibiótico es el más efectivo frente a B. subtilis. ESTUDIO DE LA FLORA CUTÁNEA. IntroducciónAunque estamos acostumbrados en Microbiología a estudiar cultivos puros, esto es una situación artefactual en la Naturaleza. La mayoría de los ambientes contienen una gran variedad de microorganismos que se interrelacionan unos con otros en la lucha por crecer y sobrevivir. Un ejemplo de esta mezcla de poblaciones la tenemos en nuestro propio cuerpo. La especificidad encontrada en cada zona depende de numerosos factores entre los que se encuentran: el pH, la concentración de oxígeno, la humedad presente y el tipo de secreción asociada. En la piel se encuentran generalmente estafilococos (predominantemente S. epidermidis), estreptococos (alfa hemolíticos, no hemolíticos y enterococos), bacilos difteroides, levaduras y hongos. Por lo tanto es un buen ejemplo para el estudio de poblaciones mixtas. Por otra parte es importante diferenciar entre la flora propia que tiene un ser humano y que se define como aquella que coloniza la piel en el momento del nacimiento y que nos acompaña hasta la muerte, y la flora transitoria que es la que vamos adquiriendo a partir del contacto con el medio ambiente y conseguimos eliminar tras el lavado de la zona con agua y jabón. Con la finalidad de comprobar tanto la existencia de poblaciones mixtas, como la diferencia entre la flora propia y transitoria se ha diseñado la práctica que reseñamos a continuación, con la salvedad de que sólo se investigarán las colonias aparecidas a las 24 horas de incubación. Se ha de entender entonces que si el tiempo fuera más prolongado, el número y diversidad de microorganismos sería mucho mas alto, ya que los hongos por ejemplo son mucho más lentos en su crecimiento que las bacterias o levaduras. Material
ObjetivoEstudiar la flora cutánea propia diferenciando entre la flora permanente y la transitoria, así como la existencia de poblaciones mixtas en la Naturaleza. Técnica
ResultadosObservar las diferencias que existen tanto en número como en tipo de colonias en los sectores marcados antes y después. Realizar un Gram de cada tipo de colonia diferente y anotar la coloración obtenida y la forma del microorganismo. Observar que en la Naturaleza es normal la existencia de flora mixta más que cultivos puros. TINCION SIMPLEMaterial
Reactivos
ObjetivoTécnica de tinción que permite observar la forma y disposición de los microorganismos. Tecnica
Tiempos y coloraciones de los reactivos empleadosLos tiempos indicados en la Tabla son los establecidos según el método. Pueden modificarse dependiendo del tiempo que lleve preparado el reactivo, pero esa variación será indicada por el profesor si lo considera necesario.
ResultadosObservar la forma y disposición de los microorganismos y dibujar el campo del microscopio. TINCION DE GRAMMaterial
Reactivos
ObjetivoTécnica de tinción diferencial que permite clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, según el tipo de coloración que adquieran Técnica
10. Lavar, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. ResultadosLos microorganismos Gram positivos aparecen de color violeta mientras que los Gram negativos son de color rojo-rosado (fucsia). Dibujar el campo del microscopio. ACTIVIDAD CATALASA Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria problema tiene capacidad para degradar el peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones metabólicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios obligados o facultativos. Existen sin embargo organismos anaerobios o microaerófilos que carecen de dicha actividad, constituyendo esta prueba un importante elemento taxonómico. El ensayo es muy sencillo, pues basta con añadir una gota de agua oxigenada sobre una colonia del cultivo y observar si de ésta se empiezan a desprender burbujas de oxígeno como consecuencia de la actividad enzimática de la catalasa: 2H2O2 ==========> 2H2O + O2 |
