Resumen con el fin de aislar y caracterizar bacterias del genero azotobacter se realizo un muestreo de suelo de tierra fértil, el aislamiento se realizo en medios Ashby sacarosa libre nitrógeno.
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| PRACTICA 8: FIJACIÓN DE NITRÓGENO MOLECULAR (CARACTERIZACIÓN DE Azotobacter spp. –Técnica de gránulos de suelo) LAURA VELEZ FARDY DIAZ RESUMEN Con el fin de aislar y caracterizar bacterias del genero azotobacter se realizo un muestreo de suelo de tierra fértil, el aislamiento se realizo en medios Ashby sacarosa libre nitrógeno. Apartir del crecimiento de los granulosy de la determinación de los granulos positivos de cada caja se realizo una segunda siembras por aislamiento sobre una caja de pretri de Agar Ashby – benzoato se deja incubar por 7 dias, se pueden observar crecimiento morfológico, macro y miscroscopica luego de realizar una tinción de gram, para observar un bacilo gram negativo. Azotobacter es un microorganismo habitante regular del suelo, fijador de nitrógeno y productor de sustancias de crecimiento vegetal. Se encuentra asociado a la rizósfera (zona de raíces) y a las hojas (filósfera) de muchas plantas, donde forma unas estructuras especiales llamadas ‘quistes’. Azotobacter se puede aislar (extraer) del suelo cercano a las raíces de las plantas con técnicas y medios de cultivos ya mencionados; en los medios de cultivo se caracteriza por presentar gránulos con pigmentos de color marrones. ABSTRACT In order to isolate and to characterize bacteria of the kind azotobacter I realize a sampling soil of fertile land, the isolation I realize in means Ashby saccharose free nitrogen. Apartir of the growth of the granulosy of the determination of the positive granules of every box I realize a second you sow for isolation on a box of pretri of Agar Ashby - benzoato it is left to incubate for 7 days, morphologic growth can be observed, macro and miscroscopica after realizing a tint of gram, to observe a bacillus gram negatively. Azotobacter is a microorganism regular inhabitant of the soil, fastener of nitrogen and producer of substances of vegetable growth. It is associated with the rizósfera (zone of roots) and with the leaves (filósfera) of many plants, where it forms a few special structures called 'cysts'. Azotobacter can isolate (be (extracted) from the soil near to the roots of the plants by technologies and means of already mentioned cultures; in the means of culture it is characterized for presenting granules with brown pigments of color. Palabras claves: azotobacter, ashby benzoate, ashby sacarosa. OBJETIVO GENERAL Aislar bacterias de vida libre del género Azotobacter propias para la fijación de nitrógeno a través de la técnica de gránulos de suelo. OBJETIVOS ESPECIFICOS
METODOLOGIa  RESULTADOS I  magen 1: Vista Azotobacter microscopio Imagen 3: Muetras de suelo  Imagen 2: Gránulos sembrados en agar Ashby  Algunos trabajos de investigación con la utilización de Azotobacter spp. han demostrado las bondades de este género: reducción de la fertilización nitrogenada del 40% e incremento de los rendimientos en 25 a 50% en hortalizas; aumentos de 11% en el rendimiento de zanahoria; de 44% en maíz; de 8% en arroz y de 16% en cebada; así mismo, se han demostrado efectos positivos en tomate, trigo, papa y girasol. ANALISIS DE RESULTADOS Las bacterias nitrificantes constituyen un conjunto muy diverso de bacterias. La segunda edición del manual de Bergey situa los generos nitrificantes en tres clases y varias familias: Nitrobacter en Bradyrhizobyaceae, alfa-proteobacteria: Nitrosomonas y Nitrosospira en Nitrosomonadaceae,, Aunque todos los organismos Gram negativos aerobios sin endo espopras, capaces de oxidar amoniaco o nitriro se diferencian de forma considerable. (Prescott, M) Las bacterias encontradas en el microscopio no presentasn enndoesporas, son gram negativas, ahora bien las bacterias del genero Azotobacter no requirieron nitrógeno para desarrollarse. Orden Pseudomonadales El genero Pseudomonas es el mas importante del orden Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae . El genero Pseudomonas contiene bacilos gram negativos rectos o ligeramente curvados, de una longitud de 1.5 a 5.0 micras, que se despalzan mediante uno o varios flagelos polares y carecen de prostecas o vainas. Estas bacterias quicio heterotrofas son aerobiasy llevan a cabo un metabolismo respiratorio utilizando oxigeno y a veces nitrato como aceptor de electrones. (Prescott, M) Las bacterias vistas en el microscopio del laboratorio son bacilos gram negativos rectos, del genero Azotobacter, porque las muestras para este laboratorio fueron tomadas de suelos principalmente al lado de las raíces de las plantas, también porque estas bacterias contribuyen al crecimiento de las plantas, facilitándoles el nitrógeno atmosférico. El género Azotobacter tambien puede clasificarse en la familia Pseudomonadaceae . Este género contienen bacterias grandes y ovoides, de 1.5 a 2.0 micras de diámetro, que pueden ser móviles por la presencia de flagelos peritricos. A menudo son células pleomorfas, cuyas formas varían entre bacilos y cocos, y forman cistos a medida que el cultivo madura. (Prescott, M) En el microscopio se pudo observar bacterias ovoides, no se pudo estrablecer si habia presencia de flgelos peritricos Clasificación Taxonómica de Azotobacter Joint Genome Institute (2009) y Uniprot Consortium (2009) ubican a las bacterias del género Azotobacter dentro de la siguiente clasificación taxonómica Dominio: Bacteria Phylum: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden: Pseudomonadales Familia: Pseudomonadaceae Genero: Azotobacter Especies: A. vinelandii, A. chroococcum, A. beijerinckii Caracteristicas del genero Azotobacter Azotobacter es un género de bacterias de vida libre y que fijan nitrógeno atmosférico, que pertenece a la clase Gammaproteobacteria. Este género ha sido estudiado por más de cien años, por científicos de todo el mundo (Setubal 2009) Porque son bacterias o microorganismos procariotas tienen una estructura morfológica más simple que las bacterias eucariotas, también son de las pocas bacterias con la capacidad de fijar el nitrogeno atmosferico y llevarselo a la biomasa vegetal para su beneficio. Estas son bacterias de vida libre que crecen adecuadamente en medios sin nitrógeno. Utilizan el nitrógeno atmosférico para la síntesis de sus proteínas celulares. La proteína celular se mineraliza después de la muerte de la célula, por tanto, contribuye a la disponibilidad de nitrógeno para las plantas silvestres y los cultivos agrícolas (Agronet Sofware Pvt, 2004) Esto genera un proceso mas acelerado de crecimiento de las plantas y en los cultivos agrícolas que también los beneficia mucho, el uso de estas bacterias se podría optimizar en la biotecnología agrícola por sus propiedades ecológicas ya que no contamina el medio ambiente y es un proceso natural. Caracterización de Azotobacter Para la caracterización macroscópica y microscópica de los aislamientos para confirmar la morfología típica de bacterias del género Azotobacter. Paralelamente y como criterio de selección, se evaluó el crecimiento en agar Ashby-benzoato luego de 36 horas y la estabilidad de la pigmentación luego de tres pases sucesivos. Se obtuvieron 15 aislamientos a partir de los gránulos de suelo, de los cuales solamente dos cumplieron con los criterios establecidos, Solo salieron positivos dos puntos, de los cales uno solamente se observo en el microscopio, de pronto hubo errores en la costuccion de las cams para los granos en las cjas de petri CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
CUESTIONARIO 1. Investigue y a través de un gráfico explique el ciclo del nitrógeno. 2. A través de consulta bibliográfica, proponga detalladamente una metodología de identificación bioquímica, y una metodología de identificación molecular del microorganismo en estudio. 3. Explique el comportamiento Bioquímico y Fisiológico de la enzima nitrogenada.  La reserva principal de nitrógeno es la atmósfera (el nitrógeno representa el 78 % de los gases atmosféricos). La mayoría de los seres vivos no pueden utilizar el nitrógeno elemental de la atmósfera para elaborar aminoácidos ni otros compuestos nitrogenados, de modo que dependen del nitrógeno que existe en las sales minerales del suelo. Por lo tanto, a pesar de la abundancia de nitrógeno en la biosfera, muchas veces el factor principal que limita el crecimiento vegetal es la escasez de nitrógeno en el suelo. El proceso por el cual esta cantidad limitada de nitrógeno circula sin cesar por el mundo de los organismos vivos se conoce como ciclo del nitrógeno. Amonificación Gran parte del nitrógeno del suelo proviene de la descomposición de la materia orgánica. Estos compuestos suelen ser degradados a compuestos simples por los organismos que viven en el suelo (bacterias y hongos). Estos microorganismos utilizan las proteínas y aminoácidos para formar las proteínas que necesitan y liberar el exceso de nitrógeno como amoníaco (NH3) o amonio (NH+4). Nitrificación Algunas bacterias comunes en los suelos oxidan el amoníaco o el amonio. En ella se libera energía, que es utilizada por las bacterias como fuente energética. Un grupo de bacterias oxida el amoníaco (o amonio) a nitrito (NO-2). Otras bacterias oxidan el nitrito a nitrato, que es la forma en que la mayor parte del nitrógeno pasa del suelo a las raíces. Asimilación Una vez que el nitrato está dentro de la célula de la planta, se reduce de nuevo a amonio. Este proceso se denomina asimilación y requiere energía. Los iones de amonio así formados se transfieren a compuestos que contienen carbono para producir aminoácidos y otras moléculas orgánicas nitrogenadas que la planta necesita. Los compuestos nitrogenados de las plantas terrestres vuelven al suelo cuando mueren las plantas o los animales que las han consumido; así, de nuevo, vuelven a ser captados por las raíces como nitrato disuelto en el agua del suelo y se vuelven a convertir en compuestos orgánicos. Enzima Nitrogenasa La enzima nitrogenasa o nitrogenasa que cataliza la reducción de N2 a amonio está constituida por dos metaloproteínas, la ferroproteína o nitrogenasa reductasa, y la ferromolibdoproteína o nitrogenasa. La primera es un homodímero (alpha:alpha). Y la segunda un tretámero (alpha:alpha:beta:beta) que contiene dos grupos P (P-clusters), uno, (8Fe-7S) y el otro, (Mo:7Fe-9S): homocitrato, que constituye el cofactor conocido como FeMoco (cofactor hierro molibdeno) a nivel del cual ocurre la reducción del N2 aunque se desconoce cómo y dónde se une el substrato y es activado. La Feproteína, activada por ATP-Mg, transfiere los electrones a la nitrogenasa que a su vez los distribuye entre N2 y protones para dar amonio e hidrógeno. Esta reducción de protones es siempre concomitante con la producción de amonio. Supone una pérdida de eficiencia del proceso por la parte correspondiente de energía que consume (un 25 por ciento). Algunas especies y cepas microbianas estan provistas de una actividad hidrogenasa que recicla en parte la energía perdida por la liberación de hidrógeno. La enzima nitrogensa es facilmente inactivada por oxígeno, de tal forma que todos los sistemas fijadores han desarrollado estrategias especiales para protegerse de concentraciones elevadas de este elemento y evitar su inactivación si es que se ha sintetizado, pues la expresión de los genes nif está estrictamente regulada, tanto por oxígeno como por nitrógeno combinado a través del sistema Ntr-NifA. Estas estrategias van desde la anaerobiosis total, como en Clostridium, a la producción de gran cantidad de polisacásridos extracelulares que hacen de filtro para el oxígeno, exclusión metabólica (Azotobacter) o la compartimentación, caso de las cianobacterias. En la simbiosis Rhizobium-leguminosa, la estructura del nódulo crea el ambiente microaerobio adecuado y la leghemoglobina facilita el transporte de oxígeno al bacteroide para soportar el metabolismo aerobio requerido para obtener la energía necesaria para la reducción del N2. Los requerimientos de la fijación por el molibdeno fue ya señalada en los años 30 por Bortels, pero recientemente se han decrito nitrogenasas alternativas en ausencia de molibdeno en el medio, que contienen otros elementos de transición, como vanadio o hierro. Una vez descifrada la química de la fijación se podría abrir la posibilidad de un proceso industrial alternativo al de Haber Bosch para la obtención de fertilizante nitrogenado. |
