Nuevos criterios para la valoración del potencial de irritación y sensibilización de preparados dermofarmacéuticos




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fecha de publicación20.12.2015
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Nuevos criterios para la valoración del potencial de irritación y sensibilización de preparados dermofarmacéuticos
Dra. Mª Pilar Vinardell Martínez-Hidalgo, Profesora Titular de Fisiología, Facultad de Farmacia, Universitat de Barcelona, e-mail: mpvinardellmh@ub.edu.

Los preparados dermofarmacéuticos tienen una aplicación no sólo en la higiene y el cuidado de la piel, si no también en aspectos relacionados con la belleza. Todos estos preparados entran en contacto con la piel o sus anejos y en algunos casos su aplicación puede tener efectos no deseados. Entre estos efectos se puede citar la acción irritante provocada por el producto al ser aplicado directamente sobre la piel, el efecto fotoirritante cuando posteriormente a su aplicación incide la luz ultravioleta del sol provocando una irritación de la piel o bien un efecto sensibilizante debido a algunos de los componentes del preparado, básicamente colorantes o perfumes.
Es necesario evaluar previamente el potencial riesgo de estos productos para garantizar una seguridad total al usuario. La historia sobre la valoración del potencial de irritación de los preparados cosméticos se inicia en los años 30, cuando se detectaron en Estados Unidos, varios casos de ceguera provocada por máscaras para pestañas. Estos graves incidentes llevaron a la FDA (Food and Drug Administration) a potenciar el estudio de posibles métodos de valoración de la irritación. Como resultado de estos estudios, John H Draize desarrolló un método para evaluar el potencial de irritación ocular y dérmica y que se ha venido conociendo desde entonces como el método de Draize (Draize et al. 1944). Este método se publicó por primera vez en 1944 y se aceptó por la OECD como método oficial de valoración de la irritación.

El método utiliza el conejo como animal de experimentación. Los animales son rasurados previamente, y se les aplica el producto sobre la piel. Posteriormente se cubre la zona tratada con una gasa y se procede al vendaje del animal para evitar que se elimine el producto. Después de un tiempo de contacto con la piel, que puede variar en función de la aplicación y tipo de producto, se retira el apósito y se valoran las lesiones de la piel, en función del grado de eritema y edema provocado. La valoración es totalmente subjetiva y da una puntuación que permite clasificar a los productos según diferentes niveles de irritación. Este método ha estado muy cuestionado, no solo por los aspectos éticos de agresión a los animales, si no también por la subjetividad del mismo y la variabilidad en los resultados, así como las diferencias entre la piel humana y la del conejo.
Una modificación del método consiste en la determinación del potencial fotoirritante al someter la piel del animal a la luz ultravioleta después de haber aplicado el producto. En este caso se utilizan conejos, ratas, ratones y cobayos a los que se rasura la piel del lomo, se aplica el producto y se expone la piel a una fuente controlada de luz ultravioleta durante un cierto tiempo. Posteriormente se valora de la misma manera el grado de irritación por la aparición de edema y eritema (Lovell and Sanders, 1992; Vohr et al. 2000).
Los ensayos de sensibilización se han realizado en animales siendo el método de maximización realizado en cobayas el más utilizado. Dicho método fue descrito por Magnusson y Kligman en 1969. Se rasura la piel del cobaya y se realiza una inyección intradérmica del producto en estudio junto con adyuvante de Freund para potenciar el efecto sensibilizante. Una semana después se aplica el producto tópicamente y se mantiene durante 48 horas mediante un vendaje oclusivo. A los 21 días se vuelve a aplicar el producto y se mantiene durante 24 horas y después de retirar el apósito y el producto se valora la aparición de edema o eritema a las 48 y 72 horas de la aplicación del producto. El ensayo es largo ya que se tarda más de 21 días y requiere el uso de numerosos animales entre controles y tratados.
La opinión pública y las organizaciones de defensa de los animales han criticado duramente la utilización de animales de experimentación para la valoración del potencial efecto irritante y sensibilizante de los preparados cosméticos, resaltando la necesidad de sustituirlos por métodos in vitro.
La prohibición de ensayos de cosméticos con animales viene de la Directiva 2003/15/CE del Parlamento Europeo y en España del Real Decreto 209/2005 25 de febrero. Si bien en muchos casos no se dispone de métodos alternativos totalmente validados y aceptados por las legislaciones, por lo que resulta difícil su aplicación.
En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos alternativos para suplir los métodos tradicionales. Estos nuevos métodos han de ser previamente validados, es decir se tiene que demostrar su eficacia, y reproducibilidad para sustituir a los métodos con animales. Los ensayos de validación son muy complejos, requiriendo la participación de varios laboratorios que simultáneamente ensayen los métodos y la posterior evaluación de los resultados obtenidos. En Europa se creó en 1991 ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) ubicado en Ispra, cerca de Milán. Se fundó para cumplir con las necesidades de la Directiva Europea sobre protección de los animales de experimentación y su función es apoyar activamente al desarrollo, validación y aceptación de métodos alternativos con la finalidad de reducir, refinar y reemplazar el uso de animales de laboratorio. También es responsable de una base de datos sobre métodos alternativos y de la organización de reuniones de expertos en métodos alternativos.

El proceso de validación de nuevos métodos es complejo y comprende desde el desarrollo del método en un determinado laboratorio, un ensayo previo de prevalidación en el que participan pocos laboratorios y el posterior estudio de validación en el que están implicados más laboratorios. Con los datos de los diferentes laboratorios se procede a la evaluación del método y la posterior aceptación por las autoridades reguladoras, siendo esta última fase del proceso la más compleja y lenta.

El proceso es muy largo, así para la fase de prevalidación y validación y revisión se necesitan más de 4 años y más de 7 años para se aceptados por las autoridades reguladoras, a parte del tiempo requerido para el desarrollo e investigación de un nuevo método

Para validar un ensayo se necesita demostrar la necesidad del método para suplir al método in vivo ya existente, disponer de indicadores del efecto biológico que se presenta in vivo, un protocolo experimental bien desarrollo, que el método sea reproducible en el propio laboratorio y en otros laboratorios. También se necesitan productos de referencia de efecto in vivo muy conocido, que el método tenga una relación con datos toxicológicos y que el procedimiento cumpla las buenas prácticas de laboratorio (Hartung et al. 2002).

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Los métodos in vitro han de reproducir las respuestas que tienen lugar en el organismo por efecto de los productos. Es necesario conocer la estructura de la piel y de las células que son responsables de estos fenómenos. En la piel existe una primera capa o epidermis en las que los queratinocitos son las células mayoritarias y una capa más interna o dermis con numerosos fibroblastos. En la epidermis también hay un pequeño número de células de defensa o células de Langerhans.

Así los ensayos de irritación dérmica tienen en cuenta los fenómenos que suceden en la piel. Un producto irritante al actuar sobre la piel provoca la liberación de citoquinas como la IL-1 que desencadena una serie de respuestas con la liberación de otras citoquinas (Il-6, IL-8, TNF, etc) que provocan cambios morfológicos como vasodilatación, activación de células endoteliales, etc que se traduce en síntomas visibles como eritema, edema, dolor o picor (Coquette et al. 2003).

Los dos tipos celulares mayoritarios serán los utilizados en los estudios in vitro, existiendo diferentes tipos de cultivos (primarios, líneas celulares y kits comerciales). El cultivo de un único tipo celular permite conocer los mecanismos de acción de los productos sobre estas células a nivel celular y molecular pero presentan el inconveniente que es necesario que los productos sean solubles en medios acuosos. Este tipo de estudio no se puede realizar con preparados cosméticos terminados, pero si con sus ingredientes por separado, siempre que sean solubles o se puedan solubilizar con solventes no tóxicos para las células.

Los marcadores que se utilizan para valorar la irritación comprenden los marcadores de viabilidad celular, la presencia de metabolitos del ácido araquidonico que participa en la respuesta inflamatoria, la presencia de interleuquinas liberadas como consecuencia del efecto irritante y últimamente la detección de nuevas proteínas que aparecen en las células en respuesta al efecto irritante de un producto (proteómica).

Los kits comerciales tienen la ventaja de permitir la aplicación de los preparados tal cual. Numerosas empresas han desarrollado estos kits que tienen el inconveniente de ser costosos.

El kit Irritection se basa en la utilización de una matriz con colágeno y gelatina para imitar a la piel. El producto se aplica y si es irritante provoca cambios en la matriz que pueden ser detectados por una turbidez.

Otro kit es SkinEthic que intenta similar la piel completa con sus capas y en el que se valora después de la aplicación del producto, la viabilidad celular, la presencia de citoquinas, los cambios histológicos del tejido.

Otros modelos son EpiDerm que solo equivale a la epidermis y EpiDermFT que equivale a la epidermis y a la dermis. En la actualidad estos métodos sólo se han aceptado para valorar productos corrosivos, por lo tanto sólo son útiles para evaluar productos químicos y no sirven para los productos dermofarmacéuticos (Faller et al. 2002).
El ensayo de fotoirritación es el único de los métodos que esta totalmente validado y aceptado por la legislación, apareciendo en los protocolos de la OECD para la valoración de productos químicos. El método se conoce con las siglas 3T3 NRU que corresponde a la captación del colorante rojo neutro por una línea celular de fibroblastos murinos, las células 3T3. (Spielman et al. 1998). En este método se determina la viabilidad celular después de la aplicación de diferentes concentraciones del producto en estudio y se determina el valor de la EC50 concentración que provoca una viabilidad del 50% de las células. El ensayo se repite pero sometiendo las células a una fuente controlada de luz UV y se vuelve a calcular la EC50. Si en presencia de luz UV el producto presenta una EC50 inferior que en condiciones control se considera que el producto es fotoirritante (Benavides et al. 2004).
Para que un producto produzca una sensibilización dérmica, en una persona susceptible, tiene que actuar como antígeno y se han de producir una serie de fenómenos. En primer lugar el producto tiene que ser suficientemente pequeño para atravesar la epidermis a través del estrato córneo. Una vez haya atravesado la epidermis se unirá proteínas y el conjunto se unirá a células especializadas de defensa (células de Langerhans) que actuarán como presentadoras de antígeno. Estas células unidas al antígeno y reguladas por citoquinas epidérmicas migrarán hacia los nodos linfáticos. Durante la migración las células sufren una diferenciación adquiriendo las propiedades de células maduras y serán capaces de presentar el antígeno a las células T. Estas células T específicas proliferarán y se diseminarán a través de la sangre a todo el cuerpo. En un segundo contacto con la misma sustancia el cuerpo reaccionará dando una respuesta inflamatoria local caracterizada por eritema y edema.

En la actualidad se han desarrollado varios métodos in vitro para valorar este efecto y se basan en la determinación de marcadores característicos. Se utilizan diferentes tipos de células: queratinocitos, células de Langerhans y células dendríticas.

El cultivo de queratinocitos permite diferenciar entre productos irritantes y alergénicos, provocando los primeros un incremento de la liberación de una citoquina característica la IL-1 y los segundos incrementan la producción intracelular de esta citoquina en una forma dependiente de la dosis, y así mismo incrementa la expresión de un antígeno de superficie como es el CD40.

Las células de Langerhans representan la principal célula presentadora de antígeno de la piel, representando del 1 al 3% de la células de la epidermis por lo que resultan difíciles de aislar. De todos modos se han realizado cultivo de estas células observándose cambios después de la exposición de las mismas a sustancias alergénicas. Así se han visto cambios en marcadores se superficie, moléculas de adhesión. También se ha intentado determinar la capacidad de migración de estas células ya que in vivo realizan esta función.

Debido a la dificultad para aislar las células de Langerhans se ha recurrido a otros métodos en los que se utilizan otras células presentadoras de antígeno como son las células dendríticas obtenidas de diferentes fuentes (Casati et al. 2005). También se ha visto un efecto de las sustancias alergénicas sobre estas células, incrementándose la expresión de ciertos marcadores de superficie.

Algunos alergenos se ha demostrado que provocan cambios en las expresión de algunos genes relacionados con la función inmunológica. En los últimos años el desarrollo de la Genómica constituye una prometedora área de investigación sobre el efecto de los productos sobre los diferentes genes implicados en el proceso.
Por último se están desarrollando métodos basados en la utilización de programas de ordenador y que establecen la relación entre la estructura química y la actividad de los productos a partir de bases de datos en las que se conoce bien la respuesta de los productos en función de su estructura química. Son los conocidos como (QSARs (Quantitative Structure-Activity Relationships). Estos procedimientos predicen el posible efecto tóxico de un producto basándose en sus propiedades fisicoquímicas y en la estructura de la molécula, la presencia de determinados enlaces químicos, su capacidad de unión a proteínas etc.
Los avances de las nuevas metodologías han permitido que todos aquellos ensayos que antes sólo se podían realizar en animales, en la actualidad ya se puedan realizar in vitro, si bien todavía no están aceptados mayoritariamente por las autoridades reguladores. Lo más importante es que estos métodos garanticen la seguridad del consumidor, y ya que los diferentes métodos pueden presentar diferente sensibilidad para detectar las propiedades irritantes o alergénicos de un producto se recomienda utilizar una batería de ensayos.

En la actualidad se sigue investigando para encontrar métodos fiables, basados en el conocimiento de los mecanismos fisiológicos que intervienen cuando un producto entra en contacto con la piel.

Bibliografía





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