Resumen la adaptación y la especialización de las ovejas a ambientes humanizados ha dado lugar a especies fenotípicamente muy diversas.




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fecha de publicación13.08.2016
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Validación de herramientas bioinformáticas para la detección de señales de selección en el genoma de Ovis aries.
Autora: Marta Alfaro*

Supervisoras: Dra. Otsanda Ruiz-Larrañaga* y Dra. Andone Estonba*

*Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal. Universidad del País Vasco- EuskalHerrikoUnibertsitatea (UPV/EHU), C/Barrio Sarriena s/n, CP48940, Leioa, Bizkaia.
Contacto: malfaro003@ikasle.ehu.es

ÍNDICE


Abstract-Resumen 3

Introducción 4

Efectos de la selección en el genoma 4

Antecedentes del trabajo 7

Hipótesis y objetivos 11

Materiales y Métodos 12

Simulación del experimento PoolSeq y tratamiento de secuencias 12

Detección de señales de selección en el genoma 15

Identificación de regiones CCR 16

Validación de regiones CCR 16

Resultados 17

Discusión 23

Conclusión 27

Agradecimientos 28

Bibliografía 29

ANEXO 1 32

ANEXO 2 35

ANEXO 3 36

ABSTRACT

The adaptation and specialization of sheep to the human environment has resulted in phenotypically highly diverse breeds. Artificial selection causes “selection sweep” in the genome of species by: a) increasing the linkage disequilibrium between polymorphisms, b) distorting the frequency spectrum of them, and c) increasing between-breed differentiation. The aim of this study is the validation of a bioinformatic tool designed for the identification of selection signatures in the genome. With this purpose we applied the Popoolation software to simulated PoolSeq experimental data. Popoolation is a computational program that allows an intra-population analysis by the estimation of Tajima´s D values and an inter-population analysis by Fst calculation. In all, 66 CCR (Convergent Candidate Regions) were identified as candidate regions for being selection signatures in the ovine genome. From them, 36 were previously related with production traits; therefore, Popoolation software has been validated and will be used in the ongoing study focused on Sasi-ardi and Latxa sheep breeds. Further studies focused on the new 30 CCR identified in the present work could provide relevant information to be applied in breeding and improvement programs of the species.

RESUMEN

La adaptación y la especialización de las ovejas a ambientes humanizados ha dado lugar a especies fenotípicamente muy diversas. La selección artificial provoca diversos cambios en el genoma de las especies, fenómeno conocido como "selective sweep", mediante: a) el aumento del desequilibrio de ligamiento entre polimorfismos, b) la distorsión del espectro de frecuencia de los mismos, y c) el aumento de la diferenciación entre razas. El objetivo de este estudio es la validación de una herramienta bioinformática diseñada para la identificación de señales de selección en el genoma. Hemos utilizado con ese propósito el software Popoolation a datos experimentales simulados de PoolSeq. El Popoolation es un programa bioinformático que permite el análisis intra-poblacional mediante la estima del estadístico D de Tajimay el análisis inter-poblacional mediante el cálculo del parámetro Fst. En total, se han identificado 66 regiones CCR (Convergent Candidate Regions) definidas como aquellas regiones candidatas a ser señales de selección en el genoma ovino. De ellas, 36 han podido ser validadas en las bases de datos de QTL existentes para la especie, así como a través de la bibliografía. Por tanto, se puede decir que el software Popoolation queda validado para este tipo de estudios y será utilizado para los propósitos de un proyecto similar en marcha enfocado a las razas ovinas locales Sasi-ardi y Latxa. Un análisis más exhaustivo de las 30 nuevas regiones CCR identificadas en el presente trabajo podría proporcionar información de utilidad en los programas de selección y mejora de la especie.

INTRODUCCIÓN

EFECTOS DE LA SELECCIÓN EN EL GENOMA
La historia de la civilización está estrechamente relacionada con los animales domésticos. La domesticación hizo posible la transición de la vida nómada a una sedentaria, que supuso una profunda reorientación de la sociedad humana, aumentando la estabilidad de la subsistencia y alimentando el crecimiento demográfico y la expansión [1]. Hay más de 40 especies que han sido domesticadas durante los últimos 10.000 años, contribuyendo directa o indirectamente a la producción agrícola. Estos recursos zoogenéticos son vitales para el desarrollo económico de la mayoría de los países en el mundo desempeñando un papel fundamental en la subsistencia de muchas comunidades y en la sostenibilidad de los sistemas agropecuarios [2].
La adaptación de las especies a nuevos ambientes se ha llevado a cabo mediante selección natural (que es la capacidad de sobrevivir y reproducirse en cautiverio) y selección artificial (que es la selección controlada por los seres humanos) y ha dado como resultado una amplia diversidad fenotípica dentro de estas especies [3]. Esta diversidad provoca ciertos cambios en el genoma de las especies [4].Por un lado, cuando en un determinado locus el alelo favorable para un rasgo es seleccionado, su prevalencia en la población aumenta, persistiendo durante muchas generaciones. Esta selección puede ser bien parcial o incompleta, o bien completa cuando el alelo favorable acaba fijándose en la población (Figura 1a). A su vez, dado el desequilibrio de ligamiento (LD) existente entre el alelo seleccionado y los que le rodean, la frecuencia de estos últimos también se ve modificada, arrastre que se conoce como efecto “Hitchhicking” [5]. Este hecho provoca una distorsión en el espectro de frecuencias alélicas o SFS (Site Frequency Spectrum) de la región seleccionada. Al mismo tiempo, este LD entre el alelo seleccionado y los adyacentes persiste en el tiempo hasta que la recombinación lo descompone. Todo ello trae como consecuencia una reducción en la diversidad genética o heterocigosidad de la población, lo que se conoce como “selective sweep”. Por último, la selección de diferentes regiones genómicas en una población y en otra dentro de una misma especie (por ejemplo, debido al interés por diferentes rasgos) produce un distanciamiento genético entre ellas dado que las frecuencias alélicas diferirán en una y en otra.
La identificación de estos cambios o señales de selección en el genoma puede proporcionarnos información relativa al proceso de domesticación de las especies. Existen diversos métodos para la detección de estas regiones (Figura 1).

1-Métodos basados en el SFS
Estos métodos son los que se basan en la búsqueda de aquellas distorsiones en las frecuencias de los polimorfismos o alelos seleccionados y los que le rodean (Figura 1b). Para detectar este tipo de cambios en el genoma contamos con diferentes estadísticos. La D de Tajima [6] fue la primera en utilizarse para detectar este tipo de señales, y es, hoy por hoy, el estadístico más extendido para este tipo de análisis. Este parámetro compara el número de diferencias entre pares de individuos respecto al número total de polimorfismos en una determinada región genómica. Debido a que los alelos de baja frecuencia contribuyen menos al número de diferencias por pares, un excedente de alelos raros disminuye el último valor de manera desproporcionada al primero. Por lo tanto, bajos valores de este parámetro pueden ser indicativos de selección positiva en la región que estamos analizando.
Hay otros parámetros que utilizan un enfoque similar al de la D de Tajima, como es la H de Fay y Wu que compara también el número de diferencias entre pares de individuos pero respecto al número de individuos homocigotos para el alelo derivado. Los valores bajos de H indican un exceso de alelos derivados de alta frecuencia, que sugieren que ha habido una selección positiva en la región examinada (revisado en ref. 4).

2-Métodos basados en el desequilibrio de ligamiento
Tal y como se ha mencionado, cuando el alelo de un polimorfismo concreto es seleccionado se genera un fuerte LD con los alelos que lo rodean hasta que la recombinación descompone estas asociaciones. Por lo tanto se puede dirigir el análisis hacia la detección de regiones con un alto LD en relación con su prevalencia dentro de una población (Figura 1c). Los métodos basados en el LD son particularmente útiles para la identificación de variantes o alelos que han sufrido una selección parcial en una región del genoma.
Ejemplos de estos métodos podrían ser el test LHR (Long-RangeHaplotype), que compara la frecuencia de los diferentes haplotipos existentes en una determinada región con su homocigosidad para poder así identificar aquellos haplotipos extendidos que sugieran una alta prevalencia, o el iHS (Integrated Haplotype Score) que compara el área de debajo de la curva definida por la homocigosidad de las variantes derivadas y ancestrales (revisado en ref.4).

3-Métodos basados en la diferenciación de poblaciones
Como ya se ha comentado anteriormente, diferentes poblaciones pueden estar sujetas a diferentes presiones ambientales y humanas y como resultado las frecuencias de los alelos seleccionados en una y otra pueden diferir significativamente si comparamos ambas poblaciones (Figura 1d).
La métrica más utilizada para detectar estas diferencias inter-poblacionales es el índice de fijación de Wright, Fst [7]. Grandes valores de Fst en un locus indican una diferenciación mayor entre las poblaciones, lo que sugiere que dicho locus ha sufrido un proceso de selección en alguna de las poblaciones analizadas.

4-Métodos compuestos
Dados los diferentes tipos de cambios que la selección provoca en el genoma, y los diferentes estadísticos específicos desarrollados para su detección, hoy en día numerosos autores combinan múltiples parámetros con el objetivo de proporcionar una mayor potencia y/o resolución espacial a la hora de identificar las señales de selección a lo largo del genoma(Figura 1e). Esto contribuye, a su vez, a distinguir entre los efectos causados en el genoma por una selección real en lugar de por eventos demográficos tales como la expansión o contracción de la población.
Un ejemplo es la prueba de CLR (Composite Likelihood Ratio) que evalúa la probabilidad de que un evento selectivo sea responsable de un exceso de alelos raros. Éste método utiliza la distribución espacial de las frecuencias de las mutaciones en una población dada para detectar las señales de selección. Existen variaciones posteriores de esta prueba que incluyen datos basados en LD, así como otros basados en la diferenciación de la población en relación a la frecuencia de los alelos para generar un espectro bidimensional de frecuencias [revisado en ref. 4].





Figura 1: Métodos para la detección de señales de selección: a) Diversidad poblacional. b) Distorsiones del espectro de frecuencia al seleccionarse un polimorfismo determinado. c) Incrementos del desequilibrio de ligamiento entre los polimorfismos seleccionados y los adyacentes. d) Diferenciación entre dos poblaciones. e) Métodos compuestos (tomada de ref. 4).

ANTECENDENTES DEL TRABAJO
El grupo de investigación liderado por la Dra. Andone Estonba trabaja actualmente en un proyecto basado en la detección de este tipo de señales de selección en el genoma de la especie ovina. Esta especie fue domesticada junto con otras como la porcina o bovina hace aproximadamente 9000 años, dando lugar a una vida sedentaria dedicada a la agricultura y a la cría animal y convirtiéndose en el sistema principal de producción de comida. Desde su domesticación en Asia Central y Oriente Medio, la especie se ha establecido en una amplia distribución geográfica debido a su capacidad de adaptación a las dietas de nutrición pobre, la tolerancia a las condiciones climáticas extremas y a su tamaño manejable [8] Se trata de una especie de comportamiento dócil y que vive en manadas pudiendo un solo pastor controlar un gran rebaño de ovejas. Constituye además un animal de vital importancia económica en nuestra sociedad como animal ecológico y como fuente de lana, carne y leche. Es por ello que la selección de las diferentes poblaciones ovinas se ha dirigido principalmente a la producción lechera, lanera y cárnica [9].
En concreto, el estudio que se está llevando a cabo se centra en dos razas ovinas locales. La primera es la raza Sasi-ardi; una raza local semisalvaje de la región pirenaica occidental que se utiliza principalmente como animal ecológico ya que presenta una serie de cualidades idóneas para adaptarse a terrenos abruptos y de alta pluviosidad como son una gran agilidad de movimientos y elevada rusticidad. Actualmente la raza se encuentra en un estado crítico de conservación [10], estando incluida en el Grupo de Razas Autóctonas de Protección Especial del Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España. El principal interés de esta raza estriba en que puede ser considerada como descendiente actual semisalvaje del ovino doméstico local, ya que las restantes razas ovinas de la región han estado bajo intensa selección artificial. Tal es el caso de la raza Latxa, la segunda raza en estudio. Esta es una raza propia del Norte de España, que tiene dos sub-razas como son la Latxa de Cara Negra (predominante en Navarra y Guipúzcoa) y la de Cara Rubia (predominante en Álava). Se trata en general de una raza ovina de lana áspera que ha estado bajo una fuerte selección en los últimos treinta años y que se cría principalmente por su leche para la producción de queso de tipo Idiazábal y para la venta de sus corderos.
La comparación entre el genoma de la raza Sasi-ardi, representante de la población ovina primigenia, rústica y adaptada a entornos desfavorables, y de la raza Latxa, representante de nuestro ovino actual tras la domesticación y bajo intensa selección artificial, se presenta como un escenario idóneo para la evaluación del efecto de la selección en el genoma del ovino de la región pirenaica occidental. Los resultados que se obtengan de este estudio podrían aportar información relevante sobre los efectos de la domesticación y la selección en estas razas complementando así la información existente sobre QTLs (Quantitative Trait Loci) y genes asociados a caracteres de interés en la especie. Esto, a su vez, podría dar lugar a futuros estudios genéticos con una aplicación directa en los programas de selección y mejora.
El estudio del efecto de la selección en razas ganaderas ha venido realizándose desde hace escasos años mediante genotipado de miles de SNP, generalmente, o al menos en la especie ovina y bovina, recogidos en chips de alta densidad. En este sentido, el estudio más reciente en la especie ovina siguiendo esta estrategia es el llevado a cabo por Gutiérrez-Gil et al. [10]. En él, los autores identifican diversas señales de selección a lo largo del genoma de la especie específicamente relacionadas con la producción lechera mediante la comparación de un pool de razas seleccionadas con otro pool de razas no seleccionadas. Para ello, hicieron uso del chip de genotipado OvineSNP50 BeadChip de Illumina que consta de 49.034 marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Estos marcadores fueron analizados siguiendo dos aproximaciones; por un lado, los autores han identificado las regiones genómicas con diferencias extremas en cuanto a frecuencias alélicas (Fst) entre ambas poblaciones y regiones con una reducida heterocigosidad. De este modo, en dicho estudio se identifican 6 regiones significativas siguiendo ambos métodos. Además, los mismos autores proponen algunos genes candidatos en estas regiones como responsables del posible efecto en caracteres de producción, como son, el gen ABCG2 (ATP-Binding Cassette) y el gen SPP1 (Secreted Phosphoprotein 1) localizados en el cromosoma 6.
Sin embargo, a día de hoy, las tecnologías NGS (Next Generation Sequencing) resultan ser una aproximación más rentable al uso de estos chips. Estas tecnologías son efectivas para el descubrimiento y genotipado de cientos de marcadores polimórficos a lo largo del genoma completo de cualquier organismo. Además la información para realizar estudios de genómica de poblaciones puede ser extraída del análisis del DNA de un pool de individuos de forma conjunta, estrategia denominada PoolSeq [11], que resulta ser un método efectivo de reducir los costes de secuenciación sin reducir el tamaño de muestra ni el poder estadístico. Es por ello que el grupo de investigación ha escogido esta aproximación metodológica para acometer el mencionado estudio
Si bien en ovino no existen trabajos publicados en esta línea, algunos autores ya han aplicado de forma efectiva esta aproximación PoolSeq en otras especies. Rubin et al. [12] llevaron a cabo un estudio donde resecuenciaron el genoma de la gallina, tanto de la especie doméstica como de su ancestro salvaje- Mediante la estima de la heterocigosidad a lo largo del genoma, utilizando para el análisis los más de5M de SNPs detectados, identificaron numerosas regiones candidatas a estar bajo el efecto de la selección artificial relativa a la domesticación. Uno de los hallazgos más relevantes es el del gen TSHR (Tyroid stimulating Hormone Receptor), implicado en la regulación metabólica y el calendario reproductivo como respuesta a cambios en la duración del día. Los mismos autores trasladaron esta metodología a la especie porcina [13], donde tras la resecuenciación del genoma de 8 poblaciones de cerdos y jabalíes, detectaron fuertes signos de selección en tres loci valiéndose también del cálculo de la heterocigosidad. Estos loci albergan, precisamente, 3 QTL previamente descritos en porcino involucrados en uno de los cambios morfológicos más característicos en la especie doméstica, la elongación dorsal por el aumento del número de vértebras. Posteriormente, Axelsson et al. [14] confirmaron el alto poder de resolución de la secuenciación de pools para el estudio de los efectos de la domesticación. Su trabajo, basado en la resecuenciación del genoma completo de poblaciones de perros y lobos, identifica, mediante el análisis de la Fst y la heterocigosidad de más de 3M de variantes genéticas, 36 regiones genómicas posiblemente seleccionadas durante el proceso de domesticación de la especie canina. Resalta, además, la localización en estas regiones de genes involucrados en el desarrollo del sistema nervioso, relacionados probablemente con cambios de comportamiento fundamentales para la domesticación del perro.
En los últimos años se han desarrollado diversos software bioinformáticos diseñados para la detección de señales de selección a partir de datos generados de experimentos PoolSeq. Uno de ellos es el SweeD [15], una herramienta para la detección de estas señales utilizando el método CLR mencionado anteriormente. El Pool-hmm [16], por su parte, implementa el modelo HMM (Hidden Markov Model) en el que se estima la probabilidad de que cada posición del genoma haya sido seleccionada basándose en el espectro de frecuencias alélicas. Por último, el programa Popoolation, tiene como ventaja frente a los anteriores el hecho de que permite realizar, por un lado, un análisis intra-poblacional mediante métodos basados en los cambios en el SFS, y por otro, un análisis inter-poblacional [17,18]. Ninguna de estas tres herramientas ha sido hasta el momento utilizada para la detección de señales de selección en especies domésticas.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
La selección artificial a la que la especie ovina ha sido sometida con diferentes objetivos ha provocado diversos cambios en el genoma de los individuos. La hipótesis del presente trabajo es que el software Poopolation, diseñado para la detección de este tipo cambios o señales de selección, permite detectar aquellas regiones que han sido seleccionadas para un determinado carácter. Por lo tanto, nos planteamos como objetivo la validación del software Poopolation, como herramienta bioinformática, mediante la detección de señales de selección asociadas a la producción lechera y a la producción cárnica en la especie ovina simulando un experimento PoolSeq.


MATERIALES Y MÉTODOS
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