Los enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones del organismo




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fecha de publicación26.10.2015
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ELENA GARRIDO BIOQUÍMICA 5

7 HOJAS ( J.E.Feliu )

LEHNINGER . ANDERSON
Enzimas en el plasma


  1. INTRODUCCIÓN



Los enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones del organismo.

Tienen un gran poder catalítico, con frecuencia muy superior al de los catalizadores sintéticos. Posee un alto grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran las reacciones químicas del orden de 106 - 1012 veces sin alterar el equilibrio de la reacción, y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperatura y pH. Los enzimas no se alteran ni se consumen en las reacciones en las que intervienen ; se requieren en cantidades muy pequeñas del rango de concentraciones M.

Los enzimas constituyen una de las claves para conocer el modo de sobrevivir y proliferar las células. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las rutas metabólicas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y se transforma energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos.

El estudio de los enzimas también tiene una importancia práctica inmensa. En algunas enfermedades, especialmente en las que son genéticamente heredables, puede haber una deficiencia, o incluso una ausencia total, de uno o mas enzimas en los tejidos. Ejemplos.

  1. Síndrome de Lesch-Nyhan ----- hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa

  2. Enfermedad de Gaucher ----- glucocerebrosiadsa

  3. Raquitismo dependiente de vitamina D ----- 25-Hidroxicolecalciferol-1-hidroxilasa

  4. Enfermedad de Tay-Sachs ----- hexosaminidasa A


También se pueden producir situaciones anormales por la actividad excesiva de un enzima específico.

La medición de la actividad enzimática en el plasma sanguíneo, eritrocitos, o muestra de tejido es importante en el diagnóstico de enfermedades.

A excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico, todos los enzimas son proteínas. Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Si se desnaturaliza o se disocia un enzima en subunidades, o se descompone en aminoácidos pierde su actividad catalítica. Así, las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas enzimáticas son esenciales para su actividad.

Algunos enzimas requieren un componente químico adicional llamado cofactor. Los cofactores pueden ser :

  1. Uno o varios iones inorgánicos : Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+...

  2. Un complejo orgánico o metaloorgánico llamado coenzima : NAD, NADH. FAD, FADH, Coenzima A...



Algunos enzimas requieren tanto un coenzima como uno o más iones metálicos ; si estos se unen de forma covalente, se denomina grupo prostético. Un enzima completo catalíticamente activo junto con su coenzima y/o iones metálicos se denomina holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomina apoenzima o apoproteína.
Ejemplo :

Grupo épsilon-amino de una Lisina + biotina piruvatocarboxilasa

holocarboxilasa sintetasa
La catálisis enzimática de las reacciones es esencial para los sistemas vivos. La mayoría de las moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso presente en el interior de las células. Muchas reacciones comunes suponen situaciones desfavorables o poco probables en el ambiente celular. Un enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente dentro del cual una reacción determinada es, energéticamente, más favorable. El rasgo distintivo de una reacción catalizada enzimáticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa del enzima denominada sitio activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa el enzima se denomina sustrato.
E + S ES EP E + P E= enzima. S= sustrato. P= producto
La energía de los sistemas biológicos se describe en función de la energía libre, G. En su estado basal ( forma estable ) cualquier molécula contiene una cantidad característica de energía libre. El equilibrio entre S y P refleja la diferencia de energía libre de sus estados basales. En el ejemplo de la figura 1, la energía libre del estado basal de P es inferior al de S,, por lo que la variación de energía libre estándar de la reacción es negativa, con lo que el equilibrio favorece a P. Este equilibrio no es afectado por ningún catalizador. No obstante el equilibrio favorable no indica que la conversión S P sea rápida. Existe una barrera energética entre S y P que representa la energía requerida para el alineamiento de los grupos reactivos, formación de cargas inestables transitorias, reordenamiento de enlaces y otras transformaciones que se requieren para que la reacción tenga lugar en cualquiera de las dos direcciones. Para que haya reacción las moléculas han de superar esta barrera por lo que se deben llevar a un nivel energético superior. El estado de transición es un momento molecular fugaz en el que acontecimientos tales como rotura de enlace, formación de enlace y desarrollo de carga han llegado al preciso instante en el que el colapso a sustrato o producto es igualmente probable. La diferencia entre los niveles de energía del estado basal y del estado de transición se denomina energía de activación. La velocidad de una reacción refleja esta energía de activación, a una energía de activación más elevada corresponde una reacción más lenta. Los enzimas mediante la catálisis disminuyen la energía de activación, de forma que aumenta la velocidad de reacción.

Las energías de activación son barreras energéticas para las reacciones químicas, estas barreras son cruciales para la propia vida. La estabilidad de una molécula aumenta con la altura de su barrera de activación. Sin tales barreras energéticas, las moléculas complejas revertirían espontáneamente a formas mas sencillas, no podrían existir ni las estructuras complejas y altamente ordenadas ni los procesos metabólicos que tienen lugar en cada célula.

Los enzimas son específicos, discriminando fácilmente entre sustratos con estructuras muy similares : ejemplos de distinta especificidad :

  1. Hexoquinasa : fosforila la glucosa, la manosa y la fructosa ( así que no es específico de un sólo sustrato ).

  2. Glucoquinasa : fosforila sólo a la glucosa.

  3. Fosfatasa alcalina : actúa sobre cualquier ester fosfórico ( tiene especificidad de enlace ).


El poder catalítico de los enzimas proviene en último término de la energía libre emitida al formarse los múltiples enlaces débiles e interacciones que se producen entre el enzima y su sustrato. Esta energía de fijación proporciona tanto especificidad como catálisis. La especificidad se refiere a la capacidad de discriminar entre dos sustratos competitivos.


  1. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA ( CINÉTICA ) :



1.- Concentración de sustrato :

A concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad inicial aumenta casi linealmente con el incremento en la concentración de sustrato. A mayores concentraciones de sustrato, la velocidad aumenta incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos de concentración de sustrato. Finalmente se alcanza un punto mas allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de velocidad con el incremento de concentración de sustrato. Esta meseta se denomina velocidad máxima. La gráfica corresponde a una hipérbola rectangular. La concentración de sustrato a la que la velocidad inicial es la mitad de la máxima es la constante de Michaelis- Menten ( Km ).Un ejemplo de enzima con este comportamiento es la hexoquinasa. ( figura 2 )

Partiendo de la hipótesis básica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones enzimáticas es la descomposición del complejo ES para formar el producto y el enzima libre, Michaelis y Menten desarrollaron la siguiente fórmula :

Vo = velocidad inicial

Vo = Vmax S / Km + S Vmax = velocidad máxima

S = concentración sustrato

Vmax = 10 Km
Cuando la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima, Km = S.
La ecuación de Michaelis-Menten se puede transformar algebraicamente en formas más útiles para representar los datos experimentales. Una transformación común se deduce simplemente tomando los inversos en ambos miembros de la ecuación, esta es la ecuación denominada de Linerwear-Burk, que da lugar a la gráfica doble recíproca ( figura 3 ).

Los enzimas alostéricos son aquellos que funcionan a través de la unión reversible, no covalente, de un metabolito regulador denominado modulador. Estos enzimas muestran una relación entre Vo y S que difiere del comportamiento normal de Michaelis-Menten : aunque se satura con el susutrato cuando S es suficientemente elevada, algunos enzimas alostéricos dan lugar a una curva de saturación sigmoidea, a diferencia de la forma hiperbólica de los enzimas no reguladores. En esta curva se utiliza el símbolo S0,5 o K0,5 para representar la concentración de sustrato que se necesita para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la reacción catalizada por un enzima alostérico. En este tipo de gráficas, cuando la velocidad es aproximadamente la mitad de la máxima, la variabilidad de la velocidad es muy grande ante oscilaciones pequeñas de S. un ejemplo de enzima al que corresponde esta gráfica es la glucoquinasa ( K0,5 = 7mM ).
2.- Concentración del enzima :
La velocidad de la reacción aumenta cuando la concentración de enzima es mayor, y disminuye cuando la concentración es menor ; sin embargo la Km es independiente de la concentración de enzima.

En una cinética hiperbólica, se pueden distinguir dos partes en la gráfica :

Cinética de primer orden : corresponde a la primera parte donde la velocidad será proporcional a S , porque existe mayor cantidad de enzima libre ( el enzima no está saturado )

Cinética de orden cero : cuando la velocidad ya es máxima y no varía aunque aumentemos S ; esto indica que todo el enzima está virtualmente como complejo ES, el enzima se encuentra saturado.

Al realizar análisis enzimáticos en el laboratorio es fundamental que S sea suficientemente elevada para favorecer la saturación enzimática, así todas las reacciones deben tener cinética de orden cero para permitir una determinación enzimática precisa.
3.- Temperatura :
-Normalmente los enzimas funcionan a 37 º C

-El aumento de temperatura favorece las colisiones entre moléculas y el enzima trabaja mejor.

-Si se realiza un aumento de 10 º C, la velocidad se multiplica por dos. Cada aumento de 1 º C, provoca un aumento del 10% de la actividad enzimática, así que es necesario controlar los análisis enzimáticos para evitar fluctuaciones de temperatura mayores de 1 º C.

-A partir de 40 º C los enzimas se desnaturalizan y dejan de funcionar.

-Un enzima puede soportar aumentos de temperatura durante un breve periodo de tiempo sin desnaturalizarse.
4.- pH :
Los cambios de ionización de los enzimas o del sustrato explican los efectos del pH.

Los enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es máxima, a valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye.

Los enzimas citosólicos actúan a pH = 7,2-7,3 ; los enzimas lisosomales actúan a pH 7,5. Si queremos obtener las propiedades reguladoras de un enzima, trabajaremos a pH fisiológico ; si por el contrario lo que queremos es sacar el máximo rendimiento, trabajaremos a pH óptimo.

Para evitar que el pH varíe considerablemente se añaden soluciones amortiguadoras al determinar la actividad enzimática en la muestra.

5.- Metabolitos reguladores :
- Inhibidores :

Competitivos : son parecidos a las moléculas de sustrato. Esta inhibición se invierte aumentando la concentración de sustrato.

No competitivos : se enlazan al enzima en un sitio distinto al sitio activo provocando un cambio en la configuración de la estructura alterando el sitio activo, sin que éste sea ya receptivo. Puede ser una inhibición reversible ( uniones débiles ) o irreversible ( enlaces covalentes )

Sin competencia : el inhibidor se une al complejo ES, así se forma un complejo I-ES, y al aumentar S se aumenta la inhibición ya que se forman mas complejos a los cuales se une el inhibidor.
- Activadores :

Aumentan la velocidad de la reacción. En general son moléculas o iones

pequeños ( por ejemplo iones metálicos ) que tienen diferentes mecanismos de acción :

- Proporcionan un sitio activo electropositivo que atrae a los grupos con

carga negativa del sustrato.

- Tienen función estructural ayudando a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria del enzima.
Puede ocurrir que al diluir la muestra la velocidad de la reacción aumente, esto indica la existencia de un inhibidor, y que gracias a la dilución se favorece la disociación Enzima- Inhibidor. Si ocurre lo contrario, y la velocidad disminuye con la disolución, indica que hay un activador.



  1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA :



El origen de los enzimas que se encuentran en la sangre puede ser variado :


  1. Enzimas propios del plasma

  2. Enzimas que trabajan en el plasma

  3. Enzimas liberados en el plasma desde la célula ( la vida media de estos enzimas depende de su liberación, del sistema retículo endotelial, de su secreción renal... )



Un enzima óptimo presenta las siguientes características :

1.- Especificidad de tejido.

2.- Medición automatizable.

3.- Estabilidad.

A + B C + D

Las opciones de medición serían : la desaparición de A o B ; o la aparición de C o D, esto último mas fácil.
Técnicas colorimétricas :

C o D mas un reactivo, dan un color determinado

Técnicas de absorción de luz a una determinada longitud de onda :

Muy útil en la deshidrogenadas, por ejemplo :
piruvato + NADH + H+ L- lactato + NAD +

lactato deshidrogenasa

A 340nm el NADH absorbe y el NAD+, el lactato y el piruvato no. Así medimos la desaparición de NADH ( medición de la caída de absorbancia ) ( figura 4 )

Una solución 1 M de una sustancia, absorbe en función de una constante (), de la longitud de la trayectoria luminosa (l) y de una concentración (c).

A = c l

A = variación de absorbancia de la muestra en un determinado periodo.

340nm = 6,22 x 103 M-1cm-1 ( coeficiente de absortividad molar del NADH )

Así una solución 1M a 25 º C en una cubeta de 1 cm de paso de luz, absorbe 6,22 x 103 unidades ópticas.
Otro ejemplo : para medir la actividad de la hexoquinasa, se acopla la reacción a la de una deshidrogenasa :

hexoquinasa

Glucosa + ATP Glucosa 6-P + ADP

Glucosa 6-P + NADP+ 6-P- Gluconato + NADPH + H +

glucosa 6-P deshidrogenasa

Definimos unidad de actividad enzimática a la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato en producto por minuto en determinadas condiciones de pH, temperatura y S ( una unidad puede estar en litro de plasma o en kg de tejido ).

El sistema internacional propone como unidad el katal, un katal es la cantidad catalítica de enzima que cataliza una reacción con una velocidad de 1mol/segundo.
1.- Curva de progreso : ( figura 5 )

La curva de progreso que representa la formación de producto tiene 3 etapas.

1.- Retraso : el enzima tiene que adaptarse al medio, dura de segundos a unos minutos.

2.- Velocidad inicial : velocidad de crucero ( lineal ) que es constante ; es la fase donde se debe determinar la actividad enzimática. Dura hasta alcanzar el equilibrio.

3.- Velocidad reducida : cinética de orden cero. Se debe a distintos factores :

-Disminución de S.

-Alcance del equilibrio

-Efectos de la inhibición del producto e inactivación progresiva del enzima a medida que la solución amortiguadora se hace insuficiente para regular el pH.
2.- Métodos de velocidad de reacción: ( figura 6 )

2.1.- Método de punto final ( también llamado de incubación fija o análisis en dos puntos ) :

Medimos la absorbancia en dos momentos distintos ( A1 y A2 ), y restamos la absorbancia en A2 menos la de A1. A partir de la absorbancia se calcula la actividad. Sus inconvenientes es que se supone que la reacción es progresiva linealmente y tiene cinética de orden cero.

2.2.- Método de puntos múltiples :
Se hace midiendo la absorbancia en múltiples momentos, lo que permite verificar si la reacción es lineal. Es más práctico ; hoy en día los microprocesadores te hacen la medición cada 20 segundos.
2.3.- Método de vigilancia contínua :
Se utiliza un espectrofotómetro con registrador para trazar el progreso de la reacción durante un periodo de varios minutos. La pendiente de la porción lineal de la curva se utiliza para determinar la actividad enzimática. Cualquier desviación de la linealidad ( que indica que la actividad enzimática es muy alta y que se agota con rapidez el sustrato ) se observa de inmediato en la gráfica de registro, y se corrige.
3.- Reacciones acopladas :

Normalmente acopladas a deshidrogenasas para medir la aparición o desaparición de NADH con óptica ultravioleta.
Ejemplo :

Creatina + ATP E1 Creatina-P + ADP ( Reacción primaria )

ADP + PEP E2 Piruvato + ATP ( Reacción auxiliar )

Piruvato + NADH + H+ E3 L- Lactato + NAD+ ( Reacción indicadora )
E1 = CK ; E2 = PK ; E3 = LDH.

E2 = 5 E1 ( para que no exista enzima limitante )

E3 = 10 E1 ( para que no exista enzima limitante )

( las gráficas y la tabla de clasificación de enzimas se encuentran en la taquilla de comisión de apuntes de sexto )






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