Es utilizado por las plantas ya sea durante el metabolismo energético, en reacciones enzimáticas, en el metabolismo fotosintético, etc., sin embargo ha sido
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ESTRÉS OXIDATIVO INTRODUCCION El oxígeno es utilizado por las plantas ya sea durante el metabolismo energético, en reacciones enzimáticas, en el metabolismo fotosintético, etc., sin embargo ha sido implicado en muchas enfermedades y condiciones degenerativas. Un elemento común en desórdenes tan diversos como: envejecimiento, aceleración de la senescencia, aumento o disminución de la resistencia frente a patógenos o a factores ambientales y muchas otras, involucran formas de oxígeno parcialmente reducidas. La comprensión del rol que cumple el oxígeno en los desórdenes y disfunciones que inducen al estrés en plantas es reciente, debido a la dificultad para detectar estas moléculas activas de oxígeno y a la extrema reactividad y velocidad de las reacciones en las que están involucradas. Las especies reactivas del oxígeno (EROS ó, en inglés AOS) se producen principalmente y en mayor proporción en aquellos compartimentos celulares donde existe una cadena transportadora de electrones como: mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas. En los procesos de producción de energía (cadena respiratoria) el oxígeno molecular es reducido por 4 electrones y se forman 2 moléculas de agua como producto final. Especies de oxígeno parcialmente reducidas o sus formas excitadas son producidas en éste y otros procesos metabólicos. Las células poseen mecanismos de detoxificación antioxidantes, enzimáticos y no enzimáticos, que evitan el daño celular que puede ocasionar un aumento de los niveles de ROS, Cuando se excede la capacidad antioxidante de las células, los ROS provocan un daño en los constituyentes celulares principalmente lípidos, proteínas y DNA . Sin embargo hay que tener en cuenta que los ROS son esenciales en la célula actuando como mecanismo de defensa frente a determinados patógenos y además son utilizados en ciertas reacciones metabólicas como por ejemplo las que involucran al citocromo P-450. ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO Y SUS PROPIEDADES QUÍMICAS Dentro de las especies reactivas del oxígeno hay que distinguir entre la forma radical y no radical. Un radical libre es aquella especie atómica o molecular que posee un electrón no apareado. Dentro de las especies reactivas del oxígeno que son radicales se encuentran: Oxígeno singulete, anión superóxido, radical hidroxilo y radical peroxihidroxilo; y dentro de los no radicales el peróxido de hidrógeno. En la figura Figura 1 se muestran las distintas especies moleculares del oxígeno y dentro de ellas sus especies reactivas. Oxigeno triplete: OO Oxigeno singulete: OO Superóxido: OO Peróxido de Hidrogeno: H OO H Radical Hidroxilo: O H Radical perhidroxilo: .O-O:H Ion hidroxilo H:O: Agua: H O H Fig. 1: Nomenclatura de varias especies moleculares de Oxígeno El oxígeno es un birradical, tiene 2 e- desapareados en orbitales diferentes pero con espines paralelos, se puede representar la estructura electrónica del orbital externo como:  O2 La activación del oxígeno puede ocurrir por dos mecanismos diferentes: a-) La absorción de suficiente energía para revertir el spin de uno de los electrones desapareados. Si esto ocurre se formará el estado singulete, en el cual los dos electrones tienen spines opuestos.  O2´ O2´´ b-) Reducción monovalente de oxígeno a la forma superóxido  O2.- El oxígeno singulete puede transferir su energía de oxidación a otras moléculas biológicas o continuar con ellas pero formando endoperóxidos o hidroperóxidos. Puede durar hasta 4 s en agua y 100 s en solventes polares. El radical superóxido puede actuar tanto como oxidante ó como reductor. Puede oxidar sulfuros, ácido ascórbico y NADPH y puede reducir citocromos y iones metálicos. El O2.- por dismutación, enzimática ó espontánea, produce peróxido de hidrógeno (reducción univalente) el cual no es un radical libre porque sus electrones están apareados. El radical superóxido es moderadamente reactivo, tiene una vida media de aproximadamente 2-4 s, no puede atravesar las membranas biológicas y rápidamente dismuta a peróxido de hidrógeno.  H2O2 El H2O2 es moderadamente reactiva y tiene una vida media larga (1 ms) pudiendo difundir a ciertas distancias desde sus sitios de producción, inactivando enzima por oxidación de sus grupos tioles. La reactividad del peróxido de hidrógeno no es debida a la reactividad per se, sino a que éste en presencia de un metal reductor forma el radical hidroxilo altamente reactivo, siendo ésta última la especie más fuertemente oxidante conocida que reacciona con moléculas orgánicas. HO.  La presencia de un electrón desapareado vuelve a la especie altamente reactiva La actividad relativa del radical hidroxilo es de 107 tomando como cero la actividad del superóxido. Estas velocidades se basan en la reacción que estas especies tienen para separar los hidrógenos de doble enlace de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) tales como el ácido linoleico ó araquidónico. A fines del siglo XIX (1899) Fenton describió el potencial oxidante del agua oxigenada mezclada con sales ferrosas. Pocos años mas tarde, Haber y Weiss (1934) identificaron al radical hidroxilo como la especie oxidante. La reacción de formación de radical hidroxilo a partir de Fe++ se conoce como reacción de Felton:  (1)La velocidad de reacción está limitada por la concentración de ión ferroso. Por otro lado el radical superóxido alimenta la producción del mismo por reacción con la forma oxidada del hierro (Fe3+)  (2). La presencia de trazas de hierro son suficientes, el radical superóxido puede también reaccionar con el peróxido de hidrógeno y formar radical hidroxilo. O2.- + H2O2 O2 + HO. + HO- (3)  Las tres reacciones (1), (2) y (3) forma el denominado Ciclo de Haber y Weis. El radical hidroxilo es muy reactivo, capaz de oxidar compuestos orgánicos a través de dos mecanismos diferentes:
 HO. + R .ROHEl producto hidroxilado, puede intervenir en las siguientes reacciones pudiendo llegar a la formación de radical superóxido. .ROH + Fe3+ ROH + Fe2+ + H+ .ROH + O2 ROH + O2.- + H+ .ROH + .ROH R-R + 2 H2O  2) Sustracción de un átomo de hidrógeno de la misma: HO. + RH R. + H2O El radical orgánico R. puede reaccionar con una molécula de oxígeno y producir peróxido orgánico el cual puede oxidar otra molécula orgánica, Las reacciones que tienen lugar son: Sumado a las especies reactivas del oxígeno, se encuentran especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RNOS), dentro de ellas una de las más estudiadas es el óxido nítrico (NO.) que es un radical. La interacción del óxido nítrico con el anión superóxido produce otra especie reactiva, el peroxinitrito (ONOO-) que es una molécula citotóxica. FORMACIÓN DE ROS EN PLANTAS Una de las mayores diferencias entre las plantas y el resto de los organismos eucariotas, es la presencia de un compartimiento adicional, los plastidios (en particular cloroplastos). Las evidencias indican que la mayoría de las reacciones biosintéticas (fijación de carbono, síntesis de ácidos grasos, asimilación de N2, biosíntesis de pigmentos, etc.) se realizan en estos compartimientos, tanto en tejidos fotosintéticos como en tejidos no-fotosintéticos. En la siguiente figura se muestra una célula vegetal con sus compartimentos subcelulares.  Fig.2: Célula vegetal y sus compartimentos subcelulares Pared de célula adyacente Pared celular Vacuola central Mitocondria Peroxisoma Sitios de producción de ROS en vegetales Las reacciones con oxígeno activado y substratos orgánicos son complejas aún en soluciones homogéneas in vitro, sin embargo en sistemas biológicos hay aún más complicaciones debido a las propiedades superficiales de las membranas, cargas eléctricas, propiedades de unión a macromoléculas y compartimentalización de enzimas y substratos. Así, varios sitios dentro de una misma célula difieren en la naturaleza y extensión de las reacciones con oxígeno. Si bien se conoce desde hace tiempo la producción de ROS durante el metabolismo normal, principalmente la fotosíntesis y la respiración, otras fuentes de producción se han ido encontrando como por ejemplo en peroxisomas, por acción de la glicolato oxidasa, durante la fotorrespiración en situaciones de estrés abiótico,. En los últimos años se han identificado en plantas NADPH oxidasas, amino oxidasas y peroxidasas unidas a pared. Estas últimas están estrechamente reguladas y participan en la producción de ROS durante procesos como la muerte celular programada (PCD) y en defensa contra patógenos. La mayoría de los compartimentos celulares de las plantas son productores de ROS. Muchos de ellos son formados por dismutación del radical superóxido, principalmente en los cloroplastos (Fig. 3)    Fig.3: Compartimentos celulares donde se producen EROS en una célula vegetal Los principales sitios y vías de producción de ROS son: 1.- Cloroplastos: Cadena de transporte del fotosistema I (PSI) y centro de reacción del PSII, clorofila fotoactivada y en la fotorrespiración. 2.- Peroxisomas: Oxidación de glicolato en el carbono 2. 3.- Mitocondria: Durante el transporte electrónico 4.- Microsomas: Complejo citocromo P-450 5.- Glioxisomas: oxidación de ácidos grasos. 6.- Membrana: Peroxidación de lípidos y acción de la NADPH oxidasa. 7.- Pared celular: peroxidasas y oxidasa 8.- Apoplasto: aminooxidasas participa en la formación de H2O2 Cloroplastos En cloroplasto las fuentes principales de generación de EROS es la producción de radical superóxido a través de la reacción de Mheler y los pigmentos antena. H2O + 2 O2 2 O2.- + 2 H+ + H2O2 2 O2.- + 2 H+  H2O2 + O2 Reacción de Mehler Hay al menos 4 sitios dentro del cloroplasto que pueden activar al oxígeno: 1-) El fotosistema I (PSI) puede reducir el oxígeno por la reacción de Mehler con formación del radical superóxido por fotorreducción, el cual es un importante mecanismo de activación en el cloroplasto. El lado reductor del PSI contribuye significativamente a la reducción monovalente del oxígeno bajo condiciones donde el NADP+ es limitante. La regulación del Ciclo de Calvin y el flujo de electrones durante la fotosíntesis son factores importantes que determinan el estado redox de la célula de la planta. 2-) La clorofila fotoactivada normalmente transfiere su energía de excitación a los centros de reacción de los fotosistemas, sin embargo bajo condiciones que previenen la captura de energía lumínica es utilizado el sistema de transporte de electrones, así esta energía puede excitar el oxígeno y llevarlo al estado singulete. 3-) El lado oxidante del PSII facilita la transferencia de 4 electrones (en forma individual, no de a pares) del agua al centro de reacción del PSII liberando una molécula de oxígeno. La pérdida de transferencia de electrones de este sitio al oxígeno molecular, o la liberación de productos de oxígeno parcialmente reducidos, hacen una contribución relativamente menor a la producción de especies oxígeno activadas. 4-) La fotorrespiración el la vía más obvia de oxigenación en el cloroplasto. La enzima Rubisco cataliza la adición de O2 al carbono 2 de la Ribulosa-bis-fosfato formando fosfoglicolato y fosfoglicerato. Aunque ésta reacción no genera oxígeno activado en el cloroplasto, el subsiguiente metabolismo de glicolato en los peroxisomas si lo hace (Fig 4).  Fig. 4 Representación esquemática del sistema de transporte de electrones en la membrana del tilacoide mostrando los posibles sitios de producción de oxígeno activado Mitocondria El sistema de transporte electrónico mitocondrial es una potencial fuente de producción de ROS, superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. La mayor parte del oxígeno es consumido por la enzima citocromo oxidasa en el sistema de transporte electrónico mitocondrial, e involucra la transferencia secuencial de 4 electrones al oxígeno, liberando agua. Las mitocondrias de las plantas tienen un sitio adicional de reducción donde actúa una enzima denominada oxidasa alternativa, que se diferencia de la citocromo oxidasa por su resistencia al cianuro. Sin embargo, ninguno de estos sitios produce cantidades significativas de superóxido. Aunque las mitocondrias aisladas producen peróxido de hidrógeno y superóxido en presencia de NADH. Esto último puede ser debido a la actividad de la Ubiquinona (CoQ), complejo CoQ-Citocromo b y por las proteínas Fe-S y enzimas NADH deshidrogenasas, Bloqueando el flujo de electrones con antimicina A se produce una acumulación de ubiquinona reducida lo cual llevó a su autooxidación con posterior producción de anión superóxido. Varias observaciones han revelado que la ubiquinona es el principal generador de peróxido de hidrógeno en la cadena de transporte electrónico in vitro y el anión superóxido sería su precursor. (ver fig. 5).  . |
