Extracción e identificación de carbohidratos

LABORATORIO DE BIOQUIMICA
EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
Al finalizar la práctica el estudiante estará capacitado para:

• 
  Explicar algunas propiedades de los carbohidratos: monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
  
• 
  Revelar el fundamento teórico de las reacciones químicas de caracterización, en base a su estructura química y la naturaleza de los reactivos.
  
• 
  Extraer productos naturales a partir de alimentos del medio
  
• 
  Aplicar técnicas de reconocimiento y diferenciación de carbohidratos en productos naturales.
  

INTRODUCCION
Los carbohidratos también llamados “hidratos de carbono” son constituyentes de los tres principales grupos químicos que forman la materia orgánica junto con las grasas y proteínas. Son compuestos orgánicos presentes tanto en el reino animal como vegetal. Su principal función es proporcionar energía (4 Kcal/g) y de almacenarla (glucógeno). Tambien desempeñan una función importante para la estructura, soporte y el funcionamiento de las células, tejidos y órganos. Son productos primarios del proceso de fotosíntesis y precursores de otros materiales orgánicos.
Existen muchos tipos de carbohidratos, son abundantes y se encuentran principalmente en los alimentos tipo almidón, como la papa, yuca, arroz, fideos y pan, así como en algunas bebidas endulzadas con azúcares, en frutas y verduras. Además, 50 a 55% (hasta un 60% como promedio) de nuestra dieta contiene carbohidratos.
Desde el punto de vista químico, se consideran como polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas. Son sustancias que por hidrólisis forman monosacáridos (disacáridos), formar maltosas y dextrinas o monosacáridos (polisacáridos).
Según el número de azucares que contienen los azucares pueden ser:

• 
  Monosacáridos: No pueden dividirse por hidrólisis en carbohidratos mas simples
  
• 
  Oligosacáridos: Forman por hidrólisis 2 a 10 moles de un monosacáridos.
  
• 
  Polisacáridos: Homopolisacáridos: Producen mas de 10 moles de monosacáridos
  

(Heteropolisacáridos: A parte de producir monosacáridos forma tambien otros compuestos diferentes).

Para la identificación de carbohidratos existen varias pruebas generales y específica que tienen base en las propiedades químicas que presentan estas sustancias como:

• 
  Poder Reductor: Acción sobre sustancias colorantes, acción sobre óxidos metalices
  
• 
  Deshidratación: Reacciones furfúricas
  
• 
  Formación de compuesto de inclusión
  

Muchas de estas reacciones permiten a su vez diferencias monosacáridos cetónicos de los que poseen un grupo aldehído (Reacción de Seliwanoff), otras permiten diferenciar pentosas de hexosas (Reacción de Bial).
Algunos monosacáridos, reductores que no sean efímeros, pueden diferenciarse entre si y ser identificados, por la formación de osazonas con el reactivo de Fenilhidracina. Cada osazona tiene forma cristalina característica con un punto de fusión y rotación especifica.
REVISION BIBLIOGRAFICA

1. 
   LOS CARBOHIDRATOS
   

Según McKee (2003), los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y también en los tejidos animales, como glucosa o glucógeno. Estos sirven como fuente de energía para todas las actividades celulares vitales.

1. 
   Clasificación de los Carbohidratos
   

Atendiendo a la complejidad de su estructura los glúcidos se clasifican en:
1.1.1. Monosacáridos o azúcares simples:
Son alcoholes con 3 hasta 7 átomos de carbono que contienen un grupo aldehído o cetónico, por lo que pueden considerarse como productos de oxidación de alcoholes polivalentes en los que una función alcohólica primaria o secundaria se transforma en un grupo carbonilo (CO). Si este grupo carbonilo es terminal en la cadena, el monosacárido es una aldosa, si no se encuentra en posición terminal, el monosacárido es una cetosa.
Si se toma en cuenta el número de átomos de carbono se dividen en:

• 
  Triosas
  
• 
  Tetrosas
  
• 
  Pentosas
  
• 
  Hexosa y
  
• 
  Heptosas
  

Los monosacáridos más sencillos son los de 3 átomos de carbono: el gliceraldehído o aldehído glicérido y la dihidroxiacetona, que se obtienen por oxidación de la glicerina.
Los monosacáridos más importantes son:

• 
  Gliceraldehído y la dihidroxiacetona: ambos compuestos se encuentran en células vegetales y animales, desempeñan un papel muy importante en el metabolismo de los carbohidratos.
  
• 
  La ribosa y la desoxirribosa: Se encuentran en la naturaleza en la forma cíclica de estructura furanosa, se encuentran en los ácidos nucleicos de todas las células vivas. La ribosa es una intermediaria en la ruta metabólica de los carbohidratos y un componente de algunas enzimas.
  
• 
  La glucosa: Es el azúcar más abundante en la naturaleza. Se encuentra en frutas maduras, se conoce como dextrosa. La glucosa es el azúcar circulante de los animales; la sangre contiene aproximadamente 0.08 % de glucosa. Requiere el humano para la síntesis de la lactosa (glándulas mamarias). La galactosa se halla en vegetales y animales en forma de numerosos derivados: glucolípidos (sustancia blanca del cerebro, nervios), polisacáridos complejos (pectinas, gomas, agar-agar, mucílagos, etc.).
  

1.1.2. Disacáridos
Son glúcidos están formados por la unión de dos moléculas de monosacáridos con pérdida de agua y unidas entre sí un enlace O-glucosídico. Por esta razón al hidrolizarse se producen dos unidades monosacáridos. Su fórmula general es:


Tienen sabor dulce, cristalizan bien y son solubles en agua. El término O-glucosídico se refiere al enlace carbono-oxígeno-carbono que une a los dos componentes del acetal. Los disacáridos más comunes (naturales) son la maltosa, lactosa y sacarosa
Sacarosa: También llamada azúcar de caña o de remolacha, no se presenta en el organismo animal, aunque es un importante alimento básico, se emplea como edulcolorante de alimentos.

La sacarosa está compuesta de dos unidades monosacáridas diferentes, una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, con eliminación de una molécula de agua.
El cuerpo humano es incapaz de utilizar la sacarosa o cualquier otro disacárido en forma directa (la molécula es muy grande y no pasa las membranas celulares). El disacárido debe fragmentarse por hidrólisis. Las enzimas catalizan la reacción de hidrólisis, también se logra con HCl.


1.1.3. Homopolisacáridos: Son los carbohidratos más abundantes que existen en la naturaleza. Sirven como sustancias alimenticias de reserva y como componentes estructurales de las células. Los tres polisacáridos más importantes son: almidón, glicógeno y celulosa.
Almidón: Es el carbohidrato de reserva más importante y la fuente principal de calorías en la dieta humana. Es un polisacárido de origen vegetal que constituye la principal reserva de energía de las plantas. El almidón es un polvo blanco constituido por gránulos de estructura casi cristalina. Es insípido. Es soluble en agua fría y al calentarse en agua tiende a formar una suspensión coloidal llamada engrudo. El almidón está formado por dos fracciones estructurales: la amilosa y la amilopectina.
2. REACCIONES DE IDENTIFICACION

1. 
   Reacción de Molisch
   

Permite detectar la presencia de hidratos de carbono en una muestra; se basa en la acción hidrolizante y deshidratante que ejerce el ácido sulfúrico sobre estos compuestos. Como se sabe, los ácidos concentrados originan una deshidratación de los azúcares para rendir furfurales, que son derivados aldehídicos del furano. Los furfurales se condensan con los fenoles para dar productos coloreados característicos, empleados frecuentemente en el análisis colorimétrico.
Las pentosas y hexosas (tanto aldosas como cetosas) en presencia de ácidos minerales como el ácido sulfúrico y a temperaturas elevadas sufren procesos de deshidratación originando furfural (derivados de pentosas) o hidroximetilfurfural (derivados de hexosas)


Los monosacáridos en caliente y medio muy ácido, sufren una deshidratación que conduce a la formación de un anillo pentagonal de furfural o hidroximetilfurfural, según se parta de pentosas o hexosas. Los oligosacáridos y polisacáridos también sufren estas reacciones, ya que el medio ácido favorece la hidrólisis previa del enlace glicosídico. Los furfurales formados se combinan fácilmente con diversos fenoles y aminas, dando reacciones coloreadas.

Estos compuestos, furfural o hidroximetilfurfural, reaccionan con compuestos aromáticos (fenoles, aminas cíclicas o heterociclos) dando productos coloreados. Aunque son pruebas específicas de monosacáridos, los oligosacáridos y polisacáridos también dan positivo, ya que en medio ácido se hidroliza el enlace glicosídico. Se disponen de diferentes técnicas, dependiendo del reactivo utilizado.

2. 
   Reactivo de Fehling
   

El reactivo de Fehling, también conocido como Licor de Fehling, es una disolución descubierta por el químico alemán Hermann Von Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores. Sirve para demostrar la presencia de glucosa en muestras biológicas como la orina.
El licor de Fehling consiste en dos soluciones acuosas:

• 
  Sulfato de cobre cristalizado, 35 g; agua destilada, hasta 1.000 ml.
  
• 
  Sal de Seignette (Tartrato mixto de Potasio y Sodio), 150 g; solución dehidróxido de sodio al 40%, 3; agua, hasta 1.000 ml.
  

Ambas se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la precipitación del hidróxido de cobre (II).
El ensayo con el licor de Fehling se funda en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehído. Éste se oxida a ácido y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a óxido de cobre (I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor.
Se utiliza como reactivo para la determinación de azúcares reductores, y es útil para demostrar la presencia de glucosa en la orina, y también para detectar derivados de la glucosa como la sacarosa o la fructosa. Al reaccionar con monosacáridos, se torna verdoso; si lo hace con disacáridos, toma el color del ladrillo. (D’Ocon, 1998).

3. 
   Reacción del Lugol con los carbohidratos
   

La reacción del Lugol es un método que se usa para identificar polisacáridos. 
El almidón en contacto con el reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. Esa coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. Por lo tanto, no es una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta. Este complejo es sensible a la temperatura, ya que si se calienta el tubo, el color desaparece. Esto se debe a que las espiras del almidón se "desarman", por así decirlo, y el yodo se libera. Una vez frío, las espiras se reorganizan y se vuelve a ver el color. 

2. 
   TIPOS DE AZÚCARES
   

Según sus propiedades químicas lo glúcidos pueden ser azucares reductores y no reductores

1. 
   Azúcares reductores
   

Todos los monosacáridos (azúcares simples que no pueden descomponerse en moléculas más pequeñas) son azúcares reductores. Dos de los tres tipos de azúcares disacáridos (con dos anillos de sustancias químicas), maltosa y lactosa, tienen la estructura química abierta necesaria para actuar como agentes reductores. La estructura simple de los monosacáridos les permite romperse dos veces tan rápidamente como los disacáridos, mientras que los disacáridos se rompen en sus partes más pequeñas primero.

2. 
   Azúcares no reductores
   

El tercer tipo de disacáridos, sacarosa, y polisacáridos (azúcares con anillos químicas múltiples) son los azúcares no reductores. Los polisacáridos - almidones - tienen estructuras cerradas, que utilizan átomos libres para unir entre sí los anillos múltiples, y tardan mucho más tiempo en descomponerse.

2. 
   PRACTICA DE LABORATORIO
   

OBJETIVO GENERAL

• 
  Comprobar mediante técnicas sencillas de laboratorio, que tipo de glúcidos están presentes en determinados alimentos de consumo humano tomando como base los conocimientos teóricos adquiridos en la asignatura de bioquímica.
  

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• 
  Extraer carbohidratos de diferentes extractos vegetales
  
• 
  Identificar azucares reductores y no reductores
  
• 
  Identificar el almidón y mediante su hidrolisis determinar el poder reductor de los azucares que lo conforman.
  
• 
  Comparar los resultados obtenidos con los resultados de muestras patrón
  
• 
  Anotar e interpretar con fundamento los resultados obtenidos
  

1. 
   MATERIALES Y REACTIVOS
   

Para la extracción e identificación de carbohidratos en laboratorio se utilizaran los siguientes materiales y reactivos:

MATERIALES	REACTIVOS
Papa	Agua destilada
Remolacha	Lugol
Uva	Ácido sulfúrico
Gradillas	Solución alcohólica de alfa naftol
Cuchillo o raspador	Fehling A y B
Tubos de ensayo	Glucosa
Pipetas	Fructosa
Vasos de precipitación	Lactosa
Mortero	Sacarosa
Mechero	Almidón de papa
Hornilla ( baño María)	Almidón de yuca

2. 
   PROCEDIMIENTO
   

4.2.1 EXTRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS

• 
  Se ralla la papa lo más que se pueda, el mismo procedimiento se realiza con la remolacha. Agregar ml de agua destilada a cada preparado para formar una solución.
  

• 
  En un mortero aplastar las uvas sin pepas. En caso de tener pepas retirarlas previo a ser retiradas. Agregar ml de agua cantidad suficiente para formar una solución.
  

4.2.2. REACCIOES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS
REACCION DE MOLISCH

• 
  Enumerar 3 tubos de ensayos limpios y secos, colocar en una gradilla y agregar:
  

• 
  1ml de la solución preparada de papa al Tubo 1
  
• 
  1ml de la solución de remolacha al Tubo 2
  
• 
  1ml de la solución de uva al Tubo 3
  

• 
  Por las paredes de cada tubo dejar caer 2 gotas de solución alcohólica de alfa naftol al 1.5 %, agitar, mezclar.
  
• 
  Inclinar el tubo y añadir con cuidado por las paredes 0,5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Evitar que se mezclen los líquidos.
  
• 
  La aparición de un anillo de color violeta en la interface, denota la presencia de hidrato de
  

Carbono.
OBSERVAR

1. 
   Es de esperar que dé positiva la prueba de Molisch en los tres tubos de reacción? ¿Explique porqué?
   
2. 
   Elaborar una tabla con los resultados de las muestras ensayadas
   
3. 
   Cual es la función del ácido sulfúrico (H₂SO₄)
   
4. 
   Escriba las estructura químicas de los glúcidos presentes en cada solución problema
   
5. 
   Interpretar con fundamento lo que sucede en el tubo de reacción a través de ecuaciones químicas
   

Paralelamente se pueden realizar ensayos con sustancias patrón para verificar la identificación de carbohidratos presentes en muestras problema. Es recomendable que en cada ensayo se trabaje con ensayo en blanco para evitar una reacción falsa positiva o negativa.

SUSTANCIAS		RESULTADO REACCIONDE MOLISH
2 ml de Agua	2 gotas de Naftol + Acido Sulfúrico
2 ml de solución Sacarosa	2 gotas de Naftol + Acido Sulfúrico
2 ml de solución Fructosa	2 gotas de Naftol + Acido Sulfúrico
2 ml de solución Glucosa	2 gotas de Naftol + Acido Sulfúrico
2 ml de solución Lactosa	2 gotas de Naftol + Acido Sulfúrico

PRUEBA DEL AZÚCAR REDUCTOR

1. 
   Se toman 3 tubos de ensayo que contengan 1 ml de solución de sacarosa, 1 ml d solución de glucosa y 1 ml de solución de fructosa.
   
2. 
   A cada tubo agregar 1 m de reactivo de Fehling A y B (previamente preparado 1:1). Se calienta ambos tubos en baño de agua hasta observar cambios en la coloración. Se toman otros 2 tubos de ensayo, a cada tubo se le coloca extracto de remolcha, al otro de sacarosa y se agrega cuidosamente ácido clorhídrico
   
3. 
   Se toma otro tubo con 1 ml de almidón de papa más lugol y se lo deja calentar en agua a baño maría.
   
4. 
   Con otro tubo de ensayo se coloca 1 ml de almidón de yuca más ácido sulfúrico y se calienta en agua a baño maría.
   
5. 
   Luego del tubo de ensayo número 5 se toma 1 ml de solución se le añade nuevamente lugol y esperamos ver la coloración que toma.
   
6. 
   En otro tubo de ensayo se coloca 1 ml de almidón de yuca, agregar con cuidado ácido clorhídrico. Calentar en agua a baño maría.
   
7. 
   Luego se toma otro tubo de ensayo con 1ml de solución del paso número 7, se agrega lugol y se calienta en agua a baño maría.
   
8. 
   Se toma 1 ml de la solución de almidón del paso 7 y se coloca reactivo de Fehling Ay B . Calentar en agua a baño maria.
   

OBSERVAR Y ANOTAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS.
¿Qué cambios observa durante y después de cada ensayo?

Interpretar y explicar con fundamento el porque de los fenómenos que se producen en cada

Ensayo.