Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de cromatografía en papel




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fecha de publicación31.10.2015
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  • Mortero

  • Embudo

  • Matraz

  • Papel de filtro

  • Alcohol

  • Hojas de espinaca





Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de cromatografía en papel.



  1. Lavar las hojas de espinacas, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el alcohol y una pequeña cantidad de carbonato cálcico (que evita la degradación de los pigmentos fotosintéticos).

Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso.  Fotografía 1.

  1. Filtrar con un embudo y papel de filtro.  Fotografía 2



    Fotografía 1






    Fotografía 2









  2. Otros alumnos y alumnas machacando espinacas...

  3. Colocar el filtrado en una placa Petri, y sobre ella pon un rectángulo de unos 15 centímetros de ancho por 10 centímetros de alto doblado en V para que se mantenga en pie sobre la placa de Petri. Fotografía 3
    Dejar así el montaje y esperar unas horas. Los pigmentos se irán separando según su adsorción.Fotografía 4



fotografía 3






Fotografía 4




Al observar el papel donde hemos hecho la cromatografía, vemos cuatro bandas o zonas (figura A), que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca. Según su grado de solubilidad con el alcohol se reconocen estas bandas y en este orden:

  1. clorofila b

  2. clorofila a

  3. xantofila

  4. carotenos






Figura A

Este es el aspecto final de la cromatografía obtenida con las hojas de espinacas



NOTA: Esta experiencia puede realizarse con otras hojas verdes si no se dispone de espinacas. Es interesante realizar también esta experiencia con otras sustancias como tinta china.




®Quiored v 1.0

http://www.ugr.es/~quiored/doc/p23.pdf

1

Separación de los pigmentos de la hoja de espinaca mediante

cromatografía en capa fina

Introducción

La cromatografía en capa fina (CCF) es una forma de cromatografía de adsorción

sólido-líquido que constituye una técnica importante en Química Orgánica para el análisis

rápido de muestras que en algunos casos puede estar en el rango de los 10-9 g.

Frecuentemente se usa para el seguimiento de la evolución del progreso de una reacción, o

para el control y seguimiento de las separaciones que se producen mediante una

cromatografía en columna preparativa.

Para realizar el análisis de una muestra por CCF se utiliza un adsorbente sólido

como gel de sílice (SiO2. H2O) o alúmina (Al2O3), unido a una placa rectangular de de vidrio o

plástico. El adsorbente sirve de fase estacionaria. La muestra se aplica en disolución con un

capilar de vidrio en un extremo de la placa, pero no sobre el mismo borde. A continuación se

introduce la placa en un tanque cerrado conteniendo un disolvente o mezcla de disolventes

(fase móvil), de manera que la placa quede apoyada sobre el fondo y el punto con la

muestra, por encima del nivel del líquido. El tanque contiene una atmósfera saturada en el

disolvente para lo cual se introduce un trozo de papel de filtro que debe. La fase móvil

asciende por capilaridad, de forma que se produce el mayor o menor avance de los

componentes de de la mezcla, según su polaridad.

Procedimiento

a. Preparación de la muestra

En un mortero, machacar una hoja de espinaca con una mezcla de 4 ml de hexano y

2 ml de etanol. Con una pipeta Pasteur transferir el extracto a un tubo de ensayo y

agitar con mucha suavidad con una cantidad igual de agua, evitando la formación de





Los colores de las plantas






HAY MÁS DE LO QUE PARECE






¿DÓNDE ESTÁN LOS COLORES?









NIVEL:



2º ciclo ESO y Bachillerato









PROFESORES:



Marta López García
M.ª José Burgos Pastor
Natividad De Marco Redondo
Isabel Barrio Rodríguez









CENTRO:



I.E.S. Luis García Berlanga









JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS:



Los objetivos de estas dos experiencias son: comprobar, mediante la técnica de la cromatografía, la existencia de diferentes pigmentos presentes en las plantas, aunque no siempre se vean; y observar, con ayuda del microscopio óptico, las distintas estructuras celulares donde las plantas almacenan los pigmentos.












HAY MÁS DE LO QUE PARECE

Material necesario

  • Dos soportes con pinza, cuatro vasos de precipitados, dos matraces Erlenmeyer, dos tubos de ensayo con tapón, una gradilla, pipetas con aspirador, cristalizador, infiernillo, filtros, dos tiras de papel Wahtman n.° 1, acetona, éter, etanol, benceno, hojas de lombarda y hojas de espinaca.

Aplicación didáctica

Los colores de las plantas se deben a la combinación de los diferentes pigmentos que contienen. Para aislar y extraer dichos pigmentos se pueden utilizar diferentes procedimientos. Uno de ellos es la cromatografía, que consiste en la separación en bandas de los diferentes pigmentos en función de su solubilidad. En esta experiencia se han utilizado dos técnicas:

  • Cromatografía en papel: Se basa en la diferencia de velocidad al desplazarse los distintos pigmentos sobre una banda de papel poroso. Los pigmentos deben estar previamente disueltos en un disolvente. Los más solubles se desplazarán más deprisa y los menos solubles más despacio, apareciendo sobre el papel diferentes bandas de color. Para comprobarlo se ha utilizado un extracto de hoja de espinaca disuelto en etanol y otro de hoja de lombarda disuelto en acetona. De abajo arriba, con el extracto de espinaca se observan las siguientes bandas: clorofila a (verde claro), clorofila b (verde oscuro), xantofilas (amarilla) y carotenos (anaranjada). Con el de lombarda: clorofilas (verde), xantofilas (amarilla) y antocianinas (morada).




  • Cromatografía en tubo de ensayo: Se basa en la diferencia de solubilidad de los pigmentos. Con una mezcla de disolventes de distinta densidad, podemos conseguir

  • que los diferentes pigmentos se separen en bandas, ya que cada tipo de pigmento es soluble en un tipo de disolvente. Utilizando el mismo extracto que en el caso anterior se añade éter y agua destilada al extracto de espinaca, y benceno y agua destilada al de lombarda. Con el extracto de la espinaca se obtienen tres bandas: xantofilas (abajo), clorofila b y clorofila a (arriba). En el caso de la lombarda se obtienen: antocianinas (abajo), xantofilas y clorofilas (arriba).









¿DÓNDE ESTÁN LOS COLORES?

Material necesario

  • Microscopio óptico, portaobjetos, cubreobjetos, pinzas, bisturí, tijeras, Elodea canadiense, pétalos de rosa, patata y tomate.

Aplicación didáctica

Los pigmentos que dan color a las plantas se encuentran en el interior de unos orgánulos celulares llamados cromatóforos y vacuolas.

Los cromatóforos son orgánulos de forma ovoide rodeados por una doble membrana que almacenan pigmentos liposolubles. Pueden ser de distintos tipos:

  • Cloroplastos: Presentes en las hojas verdes y responsables de la fotosíntesis. Contienen varios tipos de pigmentos: clorofilas, de color verde; carotenos, de color rojo-anaranjado, y xantofilas, de color amarillo.

  • Cromatóforos no fotosintéticos: Contienen carotenos y xantofilas, responsables de los colores amarillo, naranja y rojo de muchas flores y frutos.

  • Leucoplastos: Son incoloros, aunque pueden almacenar sustancias, como el almidón, que les dan una coloración blanquecina. Aparecen en hojas variegadas y en órganos de reserva como raíces o rizomas, además de en plantas parásitas.

Las vacuolas son orgánulos rodeados por una membrana simple que ocupan la práctica totalidad de la célula. Son abundantes en los pétalos de las flores y contienen pigmentos hidrosolubles de dos tipos: antocianinas, que dan una coloración azul, violeta o rojo purpúreo, y antoxantinas, que originan colores amarillo pálido.

Con esta actividad se pueden observar los distintos tipos de orgánulos celulares al microscopio óptico utilizando muestras vegetales diferentes:




  • Observación de cloroplastos: Tomando hojas de Elodea, se pone sobre un porta la parte más fina de la hoja y, tras colocarle un cubre, se observa al microscopio.

  • Observación de cromatóforos: Raspando pulpa de tomate, se pone un poco sobre el porta y se procede como en el caso anterior.

  • Observación de leucoplastos: Se raspa un poco de patata con el bisturí y se procede de la misma manera.

  • Observación de vacuolas: Se corta un trocito de pétalo de rosa y, raspando con un bisturí, se separa una capita fina que se pone sobre el porta para su observación.


















Pigmentos fotosintéticos

Por el Ing. Agr. Carlos González.



Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es probablemente el color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que, además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales.

¿Qué son los pigmentos?

Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos químicos definidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinación de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada prácticamente sin sufrir modificación.

Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b . Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos.

¿Dónde están los pigmentos?

Estos pigmentos se encuentran en el interior de la células vegetales específicamente en una organela llamada cloroplasto . Los cloroplastos son simplemente plástidos que contienen pigmentos clorofílicos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenides.

¿Cómo se dividen los solventes?

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo.

En el método de extracción simple, como se desarrolla más adelante se utilizará como extractante el alcohol etílico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos no misibles y con diferente peso específico.

En el segundo método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona y como separador el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los pigmentos, y se basa en la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la técnica.

¿Qué es la energía radiante o la luz?

Para el adecuado conocimiento de la fotosíntesis, de la síntesis y propiedades de la clorofila y de muchos otros procesos vegetales, es esencial un conocimiento elemental de las propiedades físicas de la luz y otros tipos de energía radiante. Ésta se propaga a través del espacio en forma de ondas. La luz del sol o la luz blanca procedente de cualquier fuente artificial aparece como homogénea al ojo humano, pero cuando se la pasa a través de un prisma, se descompone en un espectro de colores. El orden que aparecen los colores más importantes en el espectro de la luz blanca son: el rojo, anaranjado, amarillo, amarillo-verdoso, vede, verde-azulado, azul, índigo, violeta. Cada uno de estos colores responde a un rango diferente de longitud de onda de luz. La longitud de onda es la diferencia entre dos crestas de ondas sucesivas. Las longitudes de onda que producen la luz se hallan aproximadamente entre los 3900 Å en el violeta hasta 7600 Å en la zona más alejada al rojo. Por debajo de la región de la luz visible, en la escala de energía radiante, sigue la zona del ultravioleta (UV). Aquellos que están por encima de la luz visible responden al infrarrojo (IR.).

En la actualidad, todos estos fenómenos de la luz pueden ser explicados si se admite que la luz tiene naturaleza particulada (formada por partículas). Conforme a este concepto, un rayo de luz puede ser imaginado como una corriente de pequeñas partículas, cada una de las cuales se llama fotón. Cuando tales fotones chocan contra una sustancia adecuada, su energía puede ser transferida a los electrones sobre los que golpean, realizando así reacciones fotosintéticas.

La manifestación energética de un fotón se llama cuanto. El valor energético del cuanto varía inversamente con la longitud de onda.

¿Qué es un espectroscopio?

Un espectroscopio es un aparato que nos puede decir a partir de un extracto alcohólico de hojas verdes, qué longitudes de onda o colores son capaces de ser absorbidos por los pigmentos clorofílicos. 



 

¿Cómo funciona un espectroscopio?

Se trata de colocar una lámpara puntiforme de gran intensidad encendida frente a un espectroscopio, el cual en su parte anterior presenta un orificio por donde pasa el haz de luz. Seguidamente hay un prisma que descompone la luz y la proyecta en una pantalla, en la cual se puede observar con una lente ocular, los diversos colores mencionados anteriormente. El paso a seguir es colocar entre la lámpara y el aparato un tubo de ensayo conteniendo el extracto alcohólico de las hojas verdes. Luego se pone el ojo sobre el ocular y se observa cuáles fueron los colores o longitudes de onda absorbidas por los pigmentos clorofílicos (espectro de la clorofila) y cuales son dejadas pasar sin ningún problema. Por último se puede también ver sobre el extracto alcohólico la fluorescencia, es decir, aparece el color verde por transparencia y el color rojo parduzco por reflexión.

 

Métodos de separación de pigmentos:

a) Separación de pigmentos vegetales por separación simple.

b) Separación de pigmentos vegetales por cromatografía sobre papel.

 

  1. a.      Separación de pigmentos vegetales por separación simple.

Elementos:

Mortero - Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Alcohol - Tetracloruro de carbono - Hojas de espinaca o Acelga - Bomba de vacío.

Objetivo:

Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de fases.

Técnica:

  1. Lavar las hojas de espinacas o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el solvente extractante (acetona).

Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso. Fotografía 1.

  1. 2.      Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vacío. Fotografía 2



    Fotografía 1

     



    Fotografía 2

  2. 3.      Pasar el filtrado en dos tubos de ensayo (a y b) en partes iguales. El tubo a se lo dejará para trabajar con el espectroscopio en un lugar sombrío.

  3. 4.      Al tubo b, se le agregará tetracloruro de carbono y luego se lo agitará por unos segundos. Se lo dejará reposar en una gradilla por 10 minutos.(Fotografía 7)

  4. 5.      Los pigmentos se irán separando según su adsorción o afinidad con los solventes.(Fotografía 8)

 

Fotografía 7

 

 

Fotografía 8

 

Al observar el tubo de ensayo donde se encuentran los dos solventes, vemos dos zonas (figura B), que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca o acelga. Según su grado de solubilidad con el alcohol y el tetracloruro de carbono se reconocen estas zonas heterogéneas y no miscibles en este orden:

  1. clorofila a + b + Tetracloruro de C.

  2. xantofilas y carotenoides + Alcohol

 

 



Figura B

 

b) Separación de pigmentos vegetales por cromatografía sobre papel.

Elementos:

Mortero- Embudo cribado -Kitasato - Papel de filtro - Tubos de ensayo - Acetona - Éter de Petróleo - Hojas de espinaca o Acelga - Cloruro de Calcio- Bomba de vacío - Capilar o Pipeta Pasteur - Vaso de precipitado.

Objetivo:

Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica compleja de cromatografía en papel.

 

Técnica:

1. Lavar las hojas de espinacas o acelga, retirar los nervios y ponerlas en un mortero, junto con el solvente extractante (acetona).

Triturar la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso. Fotografía 1.

2. Filtrar con un embudo, papel de filtro y bomba de vacío. Fotografía 2

3. Pasar el filtrado en un tubo de ensayo, colocar 3 a 5 perlas de Cloruro de calcio. Dejar reposar de 5 a 10 min.

4. Tomar con un capilar o pipeta el sobrenadante del tubo anterior. Sobre un rectángulo de papel de filtro de unos 15 centímetros de ancho por 10 centímetros de alto doblado en V (para que se mantenga en pie) se traza con lápiz, una línea de siembra a 3 cm de la base. Sobre la línea se realizan de 5 a 8 pasadas con el capilar cargado de pigmento dejando entre cada pasada que se evapore acetona.

5. Se coloca el papel ya sembrado en un vaso de precipitado que contendrá el solvente separador (éter de petróleo), dejándolo unos 5 a 10 min. Fotografía3

6. Los pigmentos se irán separando según su adsorción o afinidad con el solvente. Fotografía 4



Fotografía 3

 



Fotografía 4

 

Al observar el papel donde hemos hecho la cromatografía, vemos cuatro bandas o zonas (figura A), que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca. Según su grado de solubilidad con el éter de petróleo se reconocen estas bandas y en este orden:

· clorofila b

· clorofila a

· xantofila

· carotenos

 



Figura A

Este es el aspecto final de la cromatografía obtenida con las hojas de espinacas o acelga



 



Agosto 2002

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