2- nombre del curso: Análisis de flujos metabólicos aplicados a los cultivos celulares




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PROPUESTA DE CURSO PARA EL DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
1- Denominación:

Curso de la Carrera Universitaria de Posgrado “Doctorado en Ciencias Biológicas” de la

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral.
2- Nombre del curso: Análisis de flujos metabólicos aplicados a los cultivos celulares
3- Directores y coordinador del curso:

Directores: Dra. Marina Etcheverrigaray - Dr. Ricardo Kratje
4- Colaboradores del curso (se adjunta CV en el Anexo II):

ALTAMIRANO GÓMEZ, Claudia

Escuela de Ingeniería Bioquímica, Facultad de Ingeniería, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

(Valparaíso, Chile)

Ingeniera Civil Bioquímica – Doctora en Biotecnología (Universidad Autónoma de Barcelona)

Participación en el dictado de temas Nº 8, 9 y 10. Seminarios.

AMADEO, Ignacio

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral - Zelltek S.A. (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímico – Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 4. Trabajos prácticos.

BERRÍOS ARAYA, Julio

Escuela de Ingeniería Bioquímica, Facultad de Ingeniería, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

(Valparaíso, Chile)

Bioquímico – Doctor en Ciencias de la Ingeniería Mención Ingeniería Bioquímica (Pontificia Universidad

Católica de Valparaíso)

Participación en el dictado de temas Nº 8, 9 y 10. Trabajos prácticos.

BOLLATI FOGOLÍN, Mariela

Unidad de Biología Celular – Institut Pasteur de Montevideo (Montevideo, Uruguay)

Bioquímica – Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 5. Seminarios.

CEAGLIO, Natalia

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Licenciada en Biotecnología – Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 4. Trabajos prácticos.

DEPETRIS, Matías

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Licenciado en Biotecnología – (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 4. Trabajos prácticos.

ETCHEVERRIGARAY, Marina

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral – CONICET (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímica – Doctora en Bioquímica (Universidad de Buenos Aires)

Participación en el dictado de temas Nº 2 y 3. Seminarios.

FORNO, Guillermina

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral – Zelltek S.A. (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímica – Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 6. Trabajos prácticos.

KRATJE, Ricardo

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral - CONICET (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímico – Farmacéutico – Doctor en Bioquímica (Universidad de Buenos Aires)

Participación en el dictado de temas Nº 1, 3 y 7. Seminarios.

OGGERO EBERHARDT, Marcos

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral – CONICET (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímico – Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 1. Trabajos prácticos.

PRIETO, Claudio

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Bioquímico – Doctor en Ciencias Químicas (Universidad Nacional de Córdoba)

Participación en el dictado del tema Nº 2. Trabajos prácticos.

ZUQUELI, Romina

Laboratorio de Cultivos Celulares, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional

del Litoral – Zelltek SA (Santa Fe, Pcia. Santa Fe, Argentina)

Licenciada en Biotecnología – Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad Nacional del Litoral)

Participación en el dictado del tema Nº 5. Trabajos prácticos.
5- Objetivos del curso:

(Enunciados con amplitud suficiente como para brindar una idea exacta del contenido del mismo)

Uno de los mayores logros en la aplicación de la biotecnología a la terapéutica humana es el

descubrimiento y el desarrollo de fármacos recombinantes proteicos, utilizados frecuentemente

para el reemplazo o aumento de proteínas naturales en el tratamiento de numerosas patologías.

La mayoría de las proteínas secretadas por células de mamífero, incluyendo muchas proteínas de

importancia farmacológica, son - en su estado natural – glicoproteínas. Su contenido de

carbohidratos varía entre un 3% de su peso (como en la inmunoglobulina G) hasta más del 40%

(como en la eritropoyetina), y requieren de la glicosilación para su completa eficacia in vivo. Aún

más, el perfil terapéutico de un polipéptido administrado resulta fuertemente influenciado por su

glicosilación. En consecuencia, en el diseño de una proteína de uso en terapéutica humana es

esencial que su estructura se asemeje en la mayor medida posible a la del producto natural, por lo

que resulta imperioso lograr una correcta glicosilación. A la fecha se ha clonado y expresado en

células heterólogas un número significativo de glicoproteínas de importancia terapéutica, y

muchos de estos productos están hoy disponibles comercialmente. Se estima que en los próximos

años más del 50% de los nuevos productos que serán licenciados para uso en terapia humana

dependerán de procesos de cultivos celulares para su producción.

Es por ello que la optimización de la producción de biofármacos en líneas celulares de mamífero

se ha convertido en un área clave de I.+D.+I. En este sentido, el presente curso pretende:

● Transferir conocimientos y experiencia práctica en el cultivo de células de mamífero y su

utilización para la producción de anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes.

● Transferir conocimientos y experiencia práctica en la aplicación del análisis de flujos

metabólicos para la optimización de procesos biotecnológicos en general, y en particular, su

aplicación a los cultivos celulares.
6- Perfil de los alumnos a quienes está orientado el curso:

El curso está orientado a graduados en Bioquímica, Licenciatura en Biotecnología, Farmacia,

Licenciatura en Biología, Ingeniería Química, Licenciatura en Química, Veterinaria, Agronomía, o

carreras afines.
7- Fecha de iniciación y finalización:

Desde el lunes 26 de octubre de 2009 hasta el viernes 6 de noviembre de 2009.
8- Carga horaria total y distribución horaria de las actividades:

70 horas (en 2 semanas con dedicación exclusiva), según la siguiente distribución: 40 horas de

clases teóricas y 30 horas de clases prácticas y seminarios.
9- Número de vacantes si los hubiera, indicando las correspondientes a teoría y a prácticas si no fueran las mismas:

(Se indicarán los lineamientos de los criterios de selección que se emplearán, de acuerdo con el Art. 9º)

20 alumnos, siendo la inscripción en la FBCB-UNL.

La fecha límite de inscripción al curso es el 05/10/2009. En todos los casos, los candidatos serán

seleccionados según sus antecedentes científicos y académicos e intereses de trabajo.
10- Requisitos de formación previa de los inscriptos:

El curso será dictado en español. Se requiere el conocimiento del idioma inglés para el acceso a

la bibliografía. Es preferible contar con conocimientos matemáticos básicos de matrices.

Para la inscripción, adjuntar el fundamento de la solicitud de inscripción – acompañado del aval

del jefe del grupo de trabajo en el que se desempeñe – y currículum vitae completo.
11- Programa analítico del curso (ver Anexo I):

(Detallar el número de clases teóricas y prácticas, horarios y responsables de los mismos).
12- Bibliografía del curso (indicando forma de acceso a la misma):

Se listan a continuación únicamente los libros que estarán disponibles durante el cursado en el

Laboratorio de Cultivos Celulares (FBCB-UNL). No se incluyen los papers, que se entregarán para

los seminarios:

Mammalian cell biotechnology in protein production (1997) H. Hauser and R. Wagner (eds.),

ISBN 3-11-013403-9, Walter de Gruyter, Berlin, Germany.

Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy (2008) L. R. Castilho, Ậ. M.

Moraes, E. F. P. Augusto and M. Butler (eds.), ISBN 978-0-415-42304-5, Taylor and Francis

Group, Abingdon, United Kingdom.

Metabolic Engineering: Principles and Methodologies (1998) G. N. Stephanopoulos, A. A.

Aristidou and J. Nielsen (Authors), ISBN 012666260-6, Academic Press, San Diego, USA.

Bioreaction Engineering Principles (2002) G. Liden (ed.), ISBN 0306473496, Kluwer Academic

Publishers Group, New York, USA.
13- Método de evaluación y promoción del curso:

Para la promoción del curso será necesaria la asistencia a por lo menos el 80% tanto de las

clases teóricas como de las clases prácticas y seminarios así como también la aprobación de la

evaluación final y del informe de trabajos prácticos.

La evaluación final del curso se realizará en forma escrita el día viernes 6 de noviembre de 2009.
14- Currículo vital de los docentes del curso:

En el Anexo II se adjunta el currículo vital de todos los docentes del curso.
15- Derecho de inscripción, si se exigiese, forma de pago y posibilidad de la existencia de

becas:

Costo de inscripción para teóricos y prácticos: $750.

ANEXO I

PROGRAMA ANALÍTICO DEL CURSO

ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS APLICADOS A LOS CULTIVOS CELULARES”

Directores: Dra. Marina Etcheverrigaray - Dr. Ricardo Kratje
CLASES TEÓRICAS (40 hs.)

TEMA N° 1: Tecnología de células de mamífero: desarrollo y aplicaciones

Breve reseña histórica del desarrollo de la tecnología de cultivos celulares. Descripción de las

líneas celulares más comúnmente empleadas. Aplicaciones de los cultivos celulares:

i) producción de células para reemplazo de tejidos y órganos (p. ej. producción de piel para

trasplante de quemados); ii) producción de productos específicos, tales como virus (para

vacunas virales de uso humano y veterinario) y moléculas bioactivas (proteínas recombinantes,

anticuerpos monoclonales, etc.).; iii) otras aplicaciones, tales como valoración biológica de

sustancias bioactivas, evaluaciones toxicológicas, evaluaciones infecciosas y evaluaciones

nutricionales.

TEMA N° 2: Características y crecimiento de cultivos celulares

Concepto de cultivo primario, línea celular, clon. Cultivos adherentes y en suspensión.

Mantenimiento y almacenamiento de células. Bancos de Células. Características morfológicas.

Ciclo celular. Cinética de crecimiento. Tiempo de duplicación. Apoptosis. Necrosis.

TEMA N° 3: Metabolismo de las líneas celulares continuas de mamíferos

Fuentes de carbono y energía: metabolismo de glucosa, fructosa, manosa, galactosa, glutamina

en cultivos celulares. Comparación con otros tipos celulares. Subproductos tóxicos: ácido láctico

y amonio. Síntesis de precursores de la glicosilación. Estrategias metabólicas: acciones sobre el

entorno celular, sobre el proceso de cultivo y sobre la célula.

TEMA N° 4: Requerimientos nutricionales de los cultivos celulares. Monitoreo de cultivos.

Contaminantes de cultivos

Requerimientos: Componentes físico-químicos (soporte o sustrato, temperatura, presión de O2,

presión de CO2, pH, osmolaridad, sensibilidad mecánica, viscosidad, tensión superficial y

formación de espuma, humedad del incubador, potencial redox); fuentes nutritivas (energía,

carbono, nitrógeno, vitaminas, minerales); aditivos (indicador de pH, antibióticos,

antiespumantes, suero, hormonas, lípidos, proteínas específicas); clasificación de medios de

cultivos.

Monitoreo: variables medidas on-line y off-line; determinación de la concentración de células

viables y totales; de la viabilidad y nivel de enzimas deshidrogenadas; de la concentración de

nutrientes (hexosas, aminoácidos, nucleótidos) y de catabolitos (lactato, amonio); determinación

de proteínas y concentración de producto recombinante de interés; cálculo de la velocidad de

transferencia de oxígeno. Estimación de los parámetros específicos del cultivo.

Contaminantes: físicos (temperatura, presencia de burbujas, evaporación, exposición a la luz,

vibraciones, superficie desnivelada, ruido); químicos (endotoxinas, iones metálicos, plasticatos,

leachables de las membranas filtrantes); biológicos (bacterias, levaduras, hongos, micoplasma,

virus, protozoos, artrópodos) y contaminación cruzada con otras líneas celulares.

TEMA N° 5: Expresión y transferencia de genes heterólogos en células animales

Gen de interés, vector de expresión, métodos de transferencia (físicos, químicos y biológicos),

línea celular huésped, línea celular recombinante, optimización de crecimiento, metabolismo y

productividad.

TEMA N° 6: Glicosilación de proteínas recombinantes

Estructuras de oligosacáridos presentes en glicoproteínas. Enlaces O- y N-glicosídicos. Síntesis

de glicoproteínas en el retículo endoplásmico, procesamiento de los oligosacáridos en el retículo

endioplásmico y en el complejo de Golgi. Efectos de la glicosilación sobre la bio-actividad (vía

ocupación de sitios y vía alteración de la estructura primaria de oligosacáridos), sobre la

farmacocinética y sobre la inmunogenicidad. Factores del cultivo que afectan la glicosilación.

TEMA N° 7: Escalamiento de cultivos en biorreactores

Características de un sistema de producción en gran escala. Clasificación de reactores

(reactores tipo tanque agitado, reactores en columna, reactores de membrana, otros). Modos de

operación (batch, fed-batch, quimiostato, perfusión). Cultivos adherentes y en suspensión en

reactores. Dispositivos de perfusión.

TEMA N° 8: Modelos de crecimiento y formación de productos

Etapas de construcción de un modelo matemático (formulación de ecuaciones cinéticas,

establecimiento de balances de masa, ajuste de parámetros, validación del modelo). Modelos no

estructurados y no segregados. Modelos estructurados y no segregados. Modelos no

estructurados y segregados.

TEMA N° 9: Ingeniería metabólica

Biología de sistemas, contextualización. Ingeniería Metabólica, definiciones y alcances.

Metodologías de la ingeniería metabólica. Técnicas experimentales para la determinación de

fluxes intracelulares. Análisis de balance de fluxes: estimación de fluxes y predicción de fluxes.

Análisis de control metabólico: definiciones, fundamentos y aplicaciones.

TEMA N° 10: Fundamentos matemáticos del análisis de flujos metabólicos

Construcción de matriz estequiométrica. Matriz de composición elemental E. Número de

condición. Balances de masa para los m metabolitos. Ecuación central del balance de masa de

fluxes. Cálculo de variables de entrada (velocidades específicas de consumo/producción).

Criterios de clasificación de redes metabólicas: determinancia, redundancia, calculabilidad,

balanceabildad. Resolución del modelo. Aplicaciones.
CLASES PRÁCTICAS y SEMINARIOS (30 hs.)

Actividades:

● Cultivar células de mamífero en condiciones de adherencia y suspensión: células CHO

productoras de interferón-α2b humano recombinante (rhIFN-α2b) e hibridomas productores de

anticuerpos monoclonales (mAb) anti-rhIFN-α2b en escala de laboratorio en frascos T, en

frascos tipo spinner y en un biorreactor de agitación con perfusión de 5 litros de volumen de

trabajo.

● Monitorear diferentes condiciones de cultivo a través de los siguientes parámetros: concentración

celular, concentración de nutrientes y catabolitos, producción de proteínas recombinantes y

anticuerpos monoclonales. Determinación de biomasa por seco seco y de la composición

elemental de las células.

● Obtener los parámetros específicos que caracterizan el crecimiento de cultivos en las

condiciones estudiadas. Modelado de un cultivo de hibridomas.

● Análisis de balance de fluxes metabólicos. Resolución del modelo estequiométrico utilizando el

software MetaFluxNet y FluxMap. Aplicación del análisis de balance de fluxes metabólicos para

evaluar el efecto de manipulaciones ambientales sobre células CHO recombinantes y la

producción de la proteína recombinante.

● Seminarios de presentación de casos de estudio y discusión de trabajos científicos.

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