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CURSO OPTATIVO
BIOQUÍMICA DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN VEGETALES”
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia

Área de Química Biológica

Proyecto 2-3814

2015
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS
CURSO OPTATIVO

BIOQUÍMICA DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN VEGETALES”

CRONOGRAMA – Agosto 2015

Lunes 16/11

9,30 hs – Inscripción, informes, distribución de seminarios

11,30 a 13 hs - Teoría: Tema 1

17 a 19 hs – Teoría: Temas 2 y 3

Martes 17/11

9,30 a 12 hs – Teoría: Tema 4 y 5

17 a 20 hs – Teoría: Tema 6

Miercoles 18/11

9 a 12 hs – TP1: Lipoperoxidación: Determinación de MDA

15 a 18 hs –: TP 2: Determinación de fragmentación de ADN (Inicio)

Jueves 19/11

8.30 - 12 hs - TP 2: (Cont.): ADN

14 - 17 hs - TP 3: Determinación de peróxido de hidrógeno

Viernes 20/11


9 - 12 hs - TP 4: Determinación Actividad de SOD y de Proteínas Totales

16 - 19 hs - TP 4: (Cont.)

Lunes 23/11

9 - 12 hs - TP 5: Determinación de Glutatión Reducido

15 - 19 hs - Cálculos de los TP

Martes 24/11

9 a 12 hs – Discusión de los resultados de los TP

16 a 19 hs- Exposición de seminarios

Miercoles 25/11

9 a 12 hs- Exposición de seminarios

17 a 20 hs – Exposición de seminarios

Jueves 26/11

9 a 12 hs - Consultas sobre evaluación final

Evaluación escrita final – Día y hora a consensuar


DOCENTES PARTICIPANTES

Dra. Fanny Zirulnik

Dra. Alicia Molina

Dra. María Verónica Pérez Chaca

Dra. Ethel Larregle

Lic. Silvana Marsá

Técnico Gerardo Randazzo

PROGRAMA TEÓRICO

Tema 1: Bioquímica de los radicales libres. Activación del oxígeno. Reacciones biológicas de los radicales del oxígeno: daño oxidativo a lípidos, proteínas y DNA. Sitios de producción.

Tema 2: Mecanismos bioquímicos de defensa antioxidante no- enzimáticos: metabolismo del glutatión. Ácido ascórbico, tocoferol, carotenoides.

Tema 3: Mecanismos bioquímicos de defensa antioxidante enzimáticos: superóxido dismutasa, catalasa, ascorbato peroxidasa, glutatión reductasa.

Tema 4: Respuesta bioquímica de los vegetales a la toxicidad por metales pesados. Transducción de señales durante el estrés oxidativo.

Tema 5: Metabolismo de las fitoquelatinas. Tolerancia y sensibilidad.

Tema 6: Metabolismo del óxido nítrico, su papel en la bioquímica del estrés. Enzimas productoras de NADPH: isocitrato deshidrogenasa, glucosa-6 fosfato deshidrogenasa y málico deshidrogenasa.
Trabajos Prácticos

Técnicas a desarrollar en el Laboratorio:

TPNº 1: Determinación de la lipoperoxidación, cuantificación de Malonaldehído (TBARS).

TPN° 2: Determinación de la fragmentación del ADN con difenilamina

TPN° 3: Determinación de Peróxido de hidrógeno.

TPN° 4: Defensa antioxidante enzimática: Determinación de Superóxido Dismutasa. Cuantificación de proteínas por Bradford

TPN° 5: Defensa antioxidante no enzimática: Determinación de Glutatión Reducido.

Guía de técnicas complementarias:

Determinación enzimática de Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa.

Determinación de Clorofilas.

Determinación de Tioles no proteicos.

Determinación de Nitritos y Nitratos


OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL
Condiciones de desarrollo

Semillas de soja (DM-4800) son germinadas en cámaras húmedas a 26 ºC, en oscuridad durante 3 días y se desarrollan a plántulas durante 7 días, en medio hidropónico con solución nutritiva (Cakmak y Horst, 1991) bajo condiciones controladas de temperatura, luz-oscuridad y humedad relativa.
Al décimo día de desarrollo y adaptación a condiciones de hidroponia, un grupo de plántulas se somete a intoxicación con un metal pesado (40 M de CdCl2 en solución nutritiva) durante diferentes tiempos. Plántulas control se mantienen iguales tiempos en solución salina nutriente sin el contaminante.
Las hojas del primer par de las plántulas, se cosechan y homogenizan destinándolas a las distintas determinaciones.
Condiciones de Seguridad
PARA DEMOSTRAR CONDICIONES DE ESTRÉS OXIDATIVO,

SE TRABAJARÁ CON MUESTRAS VEGETALES SOMETIDAS A CONCENTRACIONES INTOXICANTES DE METALES COMO EL Cadmio

EL MANIPULEO DE LAS SOLUCIONES Y MATERIAL VEGETAL CONTAMINADO CON Cadmio DEBE HACERSE ESTRICTAMENTE

CON GUANTES
PROTEGER LA ZONA DE TRABAJO Y UTILIZAR MATERIAL DESCARTABLE O EXCLUSIVO PARA Cadmio



Ley Nacional 21.054 de Residuos Peligrosos:

Agua para irrigación - Nivel guía 10 g/L Cd2+


Contaminación experimental: 40M CdCl2 = 5 mg/L Cd2+


Obtención de los homogenatos o extractos vegetales



Hojas del primer par de varias plántulas de soja, recién cosechas o freezadas, son colocadas en un mortero, enfriadas con N2 líquido y pulverizadas finamente con el pilón. Se pesan muestras de 0,150 g del polvo del tejido, se colocan en microtubos Eppendorf y conservan a -75ºC.

En el momento de realizar el homogenato para cada determinación, se resuspende el tejido pulverizado en la solución de extracción correspondiente (buffer, TCA, etc.), en una proporción de 1:10 (ej: 0,150 g tejido en 1,5 ml). Esta suspensión se agita en vortex o agitador para tubos al menos durante 1 minuto, hasta que se observe homogénea. Los homogenatos o extractos así preparados se centrifugan a los tiempos y velocidades correspondientes y se destinan a las distintas determinaciones.

Trabajo Práctico N° 1

Determinación de la lipoperoxidación
Método del Malondialdehído (MDA)

T´BARS (Sustancias reactivas al ácido tiobarbiturico)

Introducción

El estrés oxidativo es un estado de la célula en la cual se encuentra alterada la homeostasis óxido-reducción intracelular, es decir el balance entre pro-oxidantes y antioxidantes.

La lipoperoxidación es una consecuencia del estrés oxidativo sufrido por los lípidos ante la presencia de especies reactivas del oxígeno.

El objetivo de este trabajo práctico es la evaluación de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, el mayor porcentaje de estas sustancias corresponde al malondialdehído (MDA) que es un producto de lipoperoxidación.

Las membranas celulares contienen fosfolípidos que tienen ácidos grasos con varias ligaduras dobles. Estos ácidos grasos poliinsaturados son más lábiles a la oxidación que los saturados y los monoinsaturados porque los metilenos entre dos dobles ligaduras pueden perder fácilmente un hidrógeno (hidrógeno alílico). Las especies de oxígeno reactivas que pueden robar estos hidrógenos son el HO. y el HO2. .


Figura 1. Oxidación de lípidos. Se ejemplifica una posible modificación del ácido araquidónico: a) la abstracción de un hidrógeno alílico genera un radical en un carbono, b) éste puede migrar, con lo cual hay un reacomodo de las dobles ligaduras y c) en presencia del dioxígeno se genera un radical peroxilo que d) se puede apropiar de un hidrógeno de otro lípido, con lo que se propaga la reacción.
Método (Heath RL, Packer L, 1968)

Muestra

  • Tejido vegetal fresco. Primer par de hojas verdaderas que surge de la germinación de semillas de soja (hojas simples)

Reactivos

  • Acido Tricloroacético 20% en Buffer Fosfato de Sodio (TCA 20%)

  • Acido Tricloroacético 0,1% en Buffer Fosfato de Sodio (TCA 0,1%)

  • Acido 2-tiobarbitúrico 0,5 % p/v (TBA 0,5%) en TCA 20%

  • Buffer Fosfato de Sodio pH 7,2 (0,05M) (28ml NaH2 PO4 0,2 M + 72ml Na2H PO4 0,2M, llevar a 200ml con H2 O destilada)

Equipos

  • Homogeneizador o mortero de porcelana

  • Microcentrífuga no refrigerada (15.000 x g)

  • Baño Termostático

  • Espectrofotómetro


Procedimiento

  • Preparar un homogenato, utlizando nitrógeno líquido para disgregar el tejido prácticamente a polvo y agregar TCA 0,1 %. Dilución 1:10. Ej. 150 mg de tejido en 1,5 ml de TCA 0,1 %. Homogeneizar la suspensión agitando los tubos Eppendorf en vortex. Conservar en baño de hielo.

  • Centrifugar 30 min a 14.000 x g (11.000 rpm).

  • Separar el sobrenadante y conservarlo en baño de hielo.

  • Cargar en tubos Eppendorf con la tapa perforada con un pequeño orificio, los siguientes reactivos. Se realiza un Blanco de la reacción sin la muestra en estudio y un Control sin ácido Tiobarbitúrico con su respectivo blanco.




Reactivos

Muestra (M)

(x dupilicado)

Blanco (B)

Control (C)

Blanco de C (BC)

Sobrenadante

250 l




250 l




TBA 0,5%

250 l

250 l







TCA 0,1%




250 l




250 l

TCA 20%







250 l

250 l

Calentar en baño de agua 95º C - 20 min

Enfriar rápidamente en baño de hielo – 15 min

Centrifugar a 14000 x g – 10 min (11.000 rpm, 10 min)

Con cuidado extraer el sobrenadante

Leer la Absorbancia a 532 y 600 nm


Cálculos

El contenido de malondialdehído (MDA) se realiza usando el coeficiente de extinción molar (CEM): 155 mM-1 cm-1
La concentración de MDA se expresa en:

mmoles MDA/g peso fresco de tejido

mmoles MDA = (Abs 532 – Abs 600) / CEM
Ejemplo:

Todos los valores de Absorbancia (Muestra, Blanco o Control) deben considerarse como la diferencia de la lectura a 532 nm menos a 600 nm inespecífico.
{[(Abs de M) – (Abs B)] – (Abs C – Abs BC)} x Factor
Factor = mmoles de MDA / g Peso Fresco x CEM
Bibliografía

Heath RL, Packer L (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts I: Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch Biochem Biophys 125:189-198.
Trabajo Práctico Nº 2

Determinación de la fragmentación del ADN con difenilamina

(Burton, 1956)

Reactivos

  • Buffer de lisis (pH 8)




Tris 5 mM…………..

0.0606 g

EDTA 20 mM………

0.7445 g

Tritón X-100……….

0.5 ml

Llevar a 100ml
  • DPA

Difenilamina…………….

1.5 g

Ácido acético……………

100ml

Ác. Sulfúrico…………….

1.5 ml

Acetaldehído……………

0.5 ml



Procedimiento


  1. Tomar 80 mg de tejido y cortarlo en pequeños pedacitos. Colocar dentro de un tubo eppendorf, y rotularlo como “B”.

  2. Volcar N2 líquido y triturar con un cono plástico que entra de manera precisa en los tubos de 1,5 ml.

  3. Adicionar 1 ml de buffer de lisis y vortexear vigorosamente. Este procedimiento permite la liberación de la cromatina fragmentada del núcleo después de la lisis celular (debido a la presencia de Tritón X-100 en el buffer de lisis) y disrupción de la estructura nuclear (siguiente a la quelación de Mg ++ por EDTA en el buffer).

  4. Para separar el DNA fragmentado desde la cromatina intacta, centrifugar los tubos “B” a 20.000 g por 10 minutos a 4°C (paso crítico).

  5. Transferir el sobrenadante cuidadosamente en nuevos tubos, “T”.

  6. Adicionar al pequeño pellet en tubos “B” 1 ml de buffer de lisis.

  7. Adicionar 700 µl de TCA 25% a los tubos T y B y vortexear vigorosamente.

  8. Precipitar overnight a 4 °C.

  9. Después de la incubación, recuperar el ADN precipitado centrifugando a 20.000 g durante 10 minutos a 4°C.

  10. Descartar el sobrenadante por aspiración.

  11. Hidrolizar el ADN por adición de 500 µl de TCA 5% a cada pellet y calentar 15 minutos a 90°C en un bloque calefaccionado. Preparar un blanco con 500 µl de TCA 5% solamente.

  12. A cada tubo adicionar 1 ml de solución DPA recién preparada, luego vortexear. Permitir el desarrollo de color por 4 hs a 37°C, o también puede ser overnight a temperatura ambiente.

  13. Leer la densidad óptica a 600 nm, leyendo previamente el blanco.

  14. El porcentaje de ADN fragmentado se calcula con el uso de la siguiente fórmula:


Cálculos
% de ADN fragmentado = T x 100

T + B


  • T: valor de absorbancia del tubo T a 600 nm

  • B: valor de absorbancia del tubo B a 600 nm


Trabajo Práctico N° 3

Determinación de niveles de peróxido de hidrógeno

(Singh, H.P. y col., 2006)

Introducción

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es una molécula versátil que puede estar involucrada en varios procesos celulares en condiciones normales y condiciones de estrés. Es moderadamente reactivo, oxida grupos tioles de proteínas y tiene una vida media de 1 ms.

En la célula puede ser generado por dismutación del ión superóxido, ya sea espontánea o catalizada por la enzima superóxido dismutasa. Es degradado enzimáticamente por la catalasa y por ascorbato peroxidasa (APX) en presencia de ácido ascórbico. APX junto con la monodehidroascorbato reductasa, deshidroascorbato reductasa y glutatión reductasa, degrada el H2O2 a través de la vía Foyer–Halliwell–Asada.

Bajo condiciones de estrés, el H2O2 se produce y acumula, conduciendo a un estrés oxidativo en las plantas. En presencia de metales forma el radical hidroxilo.

Crecientes evidencias indican que el H2O2 funciona como una molécula de señalización en las plantas. Por lo tanto, el control de la concentración de H2O2 es fundamental para la homeostasis celular.
Reactivos

KI 1M

TCA 0,1% p/v

Buffer PO4 K/K2 0,01M pH 7
Procedimiento

Homogenizar 0,150 g de muestra pulverizada con N2 líquido con 1,5 ml de TCA 0,1% p/v.

Centrifugar a 12000 x g por 15 min a 4ºC.

Tomar 0,25 ml del sobrenadante y agregar 0,25 ml de Buffer PO4 K/K2 0,01M pH 7 y 0,50 ml de KI 1M.

Hacer un blanco al que se agrega 0,25 ml de TCA; 0,25 ml de Buffer PO4 K/K2 0,01M pH 7 y 0,50 ml de KI 1M.

Leer el producto de oxidación del KI a 390 nm.



Reactivos (ml)

Blanco

Muestra (duplicado)

Sobrenadante

---

0,25

TCA 0,1%

0,25

---

Buffer pH 7

0,25

0,25

En el momento de leer agregar

KI 1M

0,50

0,50

Leer la absorbancia a 390 nm



Cálculos

El contenido de H2O2 es determinado usando el coeficiente de absorción molar 0,28 mM -1 cm-1 y se expresa como nmol H2O2 / g PF.

Bibliografía

Singh, H.P., Batish, D.R., Kaur, S., Arora, K., Kohli, R.K., (2006).

-Pinene inhibits growth and induces oxidative stress in roots.

Ann. Bot. 98, 1261–1269.

Trabajo Práctico N° 4

Deteminación de la Actividad de Superóxido Dismutasa (SOD)

Determinación de Proteínas Totales

(Beauchamp CO y Fridovich I, 1973)

Introducción


Las superóxido dismutasas (SODs) son metaloproteínas que catalizan la dismutación de radical superóxido a H2O2 y O2. Estas enzimas se encuentran en organismos aeróbicos donde juegan un importante papel en la defensa contra la toxicidad mediada por especies reactivas del oxígeno.
SOD

2
O2. - + 2 H + H2O2 + O2
Las isoformas de SOD conocidas son de tres clases según el cofactor metálico: Cu-ZnSOD que se halla en citosol y cloroplasto, FeSOD en cloroplastos y MnSOD en la matriz mitocondrial y peroxisomas.

(Tsang y col, The Plant Cell, 3: 783-792, 1991)

Método

(Beauchamp C O and Fridovich I. Isozymes of SOD from wheat germ.

Biochim. Biophys. Acta, 317: 50-54, 1973)
Muestra

Tejido vegetal fresco. Primer par de hojas verdaderas que surge de la germinación de semillas de soja (hojas simples).

Obtenida según la explicación dada inicialmente para todas las determinaciones.

Materiales y Equipos

Morteros - Pinzas – Tijeras – Tubos Eppendorf – Tubos de hemólisis – Pipetas automáticas – Microcentrífuga refrigerada - Espectrofotómetro
Procedimiento

Obtención de la enzima (SOD) - Preparación del homogenato

El extracto para la determinación de SOD se prepara con 0,150 g de hojas (recién cosechas o freezadas) enfriados y pulverizados con N2 líquido en un mortero. Homogeneizar con 1,5 ml de buffer de extracción frío.

El homogenato se centrifuga a 10.000 x g (11.000 rpm) durante 30 min a 4º C en ultacentrífuga refrigerada. El sobrenadante se utiliza para el ensayo de actividad de SOD.

Reactivos para el homogenato:

Buffer de Extracción

Fosfato de potasio 50 mM, pH 7 + 1 mM EDTA

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