Etapa preanalitica
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FACULTAD CIENCIAS EXACTAS NATURALES Y AGRIMENSURA - UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE CARRERA BIOQUIMICA AREA BIOQUÍMICA CLINICA ASIGNATURA QUÍMICA CLINICA JTP CEI Versión 2008 GUIA DE TRABAJO PRACTICO - LABORATORIO LIPIDOS Y LIPOPROTEINAS SERICAS Objetivos
ETAPA PREANALITICACondiciones a cumplir para el estudio de lípidos:
Si bien el colesterol no se ve afectado por menor tiempo de ayuno, se consensuó este tiempo para estandarizar las condiciones preanalíticas del estudio de lípidos. No ingerir bebidas alcohólicas en exceso 24 hs. antes.
La muestra recomendada es suero aunque se puede utilizar plasma anticoagulado con EDTA considerando un factor = 1,03 para calcular la concentración de colesterol. Algunos autores recomiendan Heparina.
Bilirrubina en concentraciones > 20 mg/dl (suero ictérico) interfiere por su espectro de absorción y porque compite a nivel de la peroxidasa inhibiendo la reacción. Hemoglobina > 15 g/dl (hemólisis moderada o severa) produce falsos aumentos. Acido ascórbico > 8 mg/dl también compite con la peroxidasa. En sueros hiperlipémicos de aspecto turbio se puede diluir el volumen final de reacción a ½ ó ⅓ con blanco de reactivos, repetir la lectura y multiplicar por la dilución. Si la lipemia origina opalescencia en la coloración final, se puede procesar un blanco de muestra para restar.
Se puede conservar el suero, en estado líquido, en heladera hasta 4 días para la determinación de colesterol y triglicéridos pero no más de 48 hs. para el fraccionamiento lipoproteico.
Como los lípidos son transportados por complejos lipoproteicos, el estancamiento del flujo sanguíneo puede dar valores falsamente aumentados. Debe minimizarse el éstasis venoso durante la venopunción.
Los cambios de concentración proteica debidos a cambios del agua plasmática se producen en 15 minutos por lo que se debe tomar la muestra al paciente sentado y con reposo previo de 5 minutos.
En las horas siguientes al ejercicio intenso puede haber moderada deshidratación extracelular y con ello, hemoconcentración que eleva la proteinemia. El efecto aumenta a mayor temperatura ambiente y nivel de ejercicio. No realizar actividad física intensa 24 hs. antes.
Debido a la elevada variabilidad encontrada para colesterol y más aún para triglicéridos, se recomienda realizar al menos 2 determinaciones con no más de 2 semanas de diferencia. BIOSEGURIDADTratar las muestras como potencialmente infecciosas. ETAPA ANALITICA1) Metodología: cuantificación de colesterol total por método enzimático manual. Fundamento Los métodos para colesterol evolucionaron desde los químicos directos en una sola etapa y los extractivos en 2, 3, y 4 etapas hasta los actuales enzimáticos, que son de elección por ser más sensibles y específicos. Aún así, el método de referencia sigue siendo el de Abell-Levy-Brodie-Kendall. El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa previa hidrólisis enzimática de los ésteres mediante una lipasa de origen fangal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona en una reacción (Trinder) catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con un máximo de absorbancia a 505 nm. TEcnica operatoria Muestra:
Material requerido:
Reactivos: Entre los distintos reactivos comerciales pueden diferir las concentraciones de las enzimas. En el TP se usará Colestat Enzimático de Wiener.
Mezclar por inversión antes de usar.
Colesterol oxidasa (3 U/ml) Peroxidasa (20 U/ml) Homogeneizar por inversión antes de usar, evitando la formación de espuma.
Reactivo de Trabajo: respetando el orden de agregado y de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes de Reactivo 4-AF, 5 partes de Reactivo Fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente homogeneizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar. Es estable 1 mes en frasco de vidrio color caramelo y en refrigerador. Se pueden preparar distintas cantidades respetando las proporciones establecidas. Desechar cuando las lecturas del Blanco superen 0,160 D.O. o cuando las del Testigo sean anormalmente bajas. Procedimiento En tubos rotulados colocar: Blanco Testigo Muestra Testigo 20 ul Suero 20 ul Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml Mezclar. Incubar en baño de agua a 37 °C durante 15 minutos. Leer en espectrofotómetro a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). Color estable 2 horas. Cálculos: factor = 200 mg/dl / Absorbancia del Testigo Colesterol (mg/dl) = Absorbancia de la Muestra x factor Unidades SI: colesterol mmol/l = colesterol mg/dl x 0,0259 colesterol mg/dl = colesterol mol/l x 39 Control de Calidad Interno: Pueden utilizarse sueros comerciales Standatrol 2 niveles (Wiener), Precinorm-Precipath (Roche) y/o pool de sueros preparado en el laboratorio obteniendo los estadísticos propios. Control de Calidad Externo: Participar de Programas Interlaboratorios reconocidos. Performance del mEtodo (WIENER):
2) Metodología: cuantificación de colesterol de HDL por método enzimático manual con precipitación selectiva previa. Fundamento Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) realizan el transporte de colesterol desde los tejidos periféricos hacia el hígado para ser metabolizado, con lo cual se evita o disminuye la proliferación y crecimiento de lesiones ateromatosas. Debido a esto se consideran un factor protector o de riesgo negativo, avalado por su correlación inversa con eventos cardiovasculares. La cuantificación de las mismas se realiza indirectamente a través de su separación de otras lipoproteínas y de la determinación del colesterol que contienen. El método de referencia para separar lipoproteínas es la Ultracentrifugación en función de sus densidades. En el laboratorio clínico, como método de elección se recurre a la separación mediante una precipitación selectiva con un polianión y un catión divalente. En el TP utilizaremos como reactivo precipitante el Sulfato de Dextran el cual se une a la apoproteína B formando un complejo que precipita en presencia de Mg++. En el sobrenadante, separado por centrifugación y con las HDL que contienen apoproteína A, se determina el colesterol empleando el sistema enzimático colesteroloxidasa/peroxidasa con colorimetría según Trinder (Wiener). TEcnica operatoria Muestra:
Material requerido:
Reactivos:
Reactivo Precipitante: respetando la proporción 1 + 1 pueden prepararse las cantidades necesarias. Mezclar por inversión, rotular y fechar. Es estable 1 año en frasco de vidrio color caramelo y en refrigerador. La contaminación bacteriana deteriora los reactivos. PROCEDIMIENTO En un tubo de Kahn medir 0,5 ml (500 ul) de muestra y agregar 50 ul de Reactivo Precipitante. Homogeneizar agitando sin invertir durante 20 segundos y dejar 30-40 minutos en refrigerador. Centrifugar 15 minutos a 3.000 rpm. Para utilizar este sobrenadante es condición que sea límpido. En tubos rotulados colocar: Blanco Testigo Muestra Testigo 20 ul Sobrenadante 100 ul Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml para colesterol enzimático Mezclar. Incubar en baño de agua a 37 °C durante 15 minutos. Leer en espectrofotómetro a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). Color estable 2 horas. Cálculos: factor = 45,7 / Absorbancia del Testigo 45,7 = 200 mg/dl x VFE x VRE x VS VM VRS VE VFE = volumen final de extracto = 0,55 ml VM = volumen de muestra procesada = 0,5 ml VRE = volumen de rección con extracto = 2,1 ml VRS = volumen de reacción con Standard = 2,02 ml VS = volumen de Standard en la reacción = 0,02 ml VE = volumen de extracto en la reacción = 0,1 ml Si se emplean volúmenes diferentes el factor varía y debe ser recalculado. HDL-Colesterol (mg/dl) = Absorbancia de la Muestra x factor Control de Calidad Interno: Pueden utilizarse sueros comerciales Standatrol 2 niveles (Wiener), Precinorm-Precipath (Roche) y/o pool de sueros preparado en el laboratorio obteniendo los estadísticos propios. Control de Calidad Externo: Participar de Programas Interlaboratorios reconocidos. Performance del mEtodo (wiener):
3) Metodología: cuantificación de colesterol de LDL por método enzimático manual con precipitación selectiva previa. Fundamento Las LDL o lipoproteínas de baja densidad distribuyen colesterol a los tejidos periféricos mientras circulan por el plasma, siendo las principales responsables de la formación de placas ateromatosas por lo que constituyen un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En el laboratorio clínico se cuantifican precipitándolas selectivamente con polímeros de alto peso molecular. En el TP utilizaremos como reactivo precipitante el Polivinilsulfato que logra precipitar las LDL, y si hubiere IDL, quedando en el sobrenadante HDL y VLDL. Se determina el colesterol ligado a éstas empleando el sistema enzimático colesteroloxidasa/peroxidasa con colorimetría según Trinder (Wiener) y por diferencia con el colesterol total se obtiene LDL-Colesterol. TEcnica operatoria Muestra:
Material requerido:
Reactivos:
PROCEDIMIENTO En un tubo de Kahn colocar 200 ul de muestra y 100 ul de Reactivo Precipitante. Homogeneizar agitando sin invertir durante 20 segundos y dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25ºC. Centrifugar 15 minutos a 3.000 r.p.m.. Separar inmediatamente el sobrenadante y determinar el colesterol. En tubos rotulados colocar: Blanco Testigo Muestra Testigo 20 ul Sobrenadante 100 ul Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml para colesterol enzimático Mezclar. Incubar en baño de agua a 37 °C durante 15 minutos. Leer en espectrofotómetro a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). Color estable 2 horas. Cálculos: factor = 62,4 / Absorbancia del Testigo 62,4 = 200 mg/dl x VFE x VRE x VS VM VRS VE VFE = volumen final de extracto = 0,3 ml VM = volumen de muestra procesada = 0,2 ml VRE = volumen de rección con extracto = 2,1 ml VRS = volumen de reacción con Standard = 2,02 ml VS = volumen de Standard en la reacción = 0,02 ml VE = volumen de extracto en la reacción = 0,1 ml Si se emplean volúmenes diferentes el factor varía y debe ser recalculado. LDL-Colesterol (mg/dl) = Colesterol total - Absorbancia de la Muestra x factor Control de Calidad Interno: Pueden utilizarse sueros comerciales Standatrol 2 niveles (Wiener), Precinorm-Precipath (Roche) y/o pool de sueros preparado en el laboratorio obteniendo los estadísticos propios. Control de Calidad Externo: Participar de Programas Interlaboratorios reconocidos. Performance del mEtodo (WIENER):
4) Metodología: cuantificación de triglicéridos por método enzimático manual. Fundamento También para triglicéridos los métodos evolucionaron desde los químicos hasta los enzimáticos, de elección por ser más sensibles y específicos. El método de referencia sigue siendo químico con ácido cromotrópico. Los triglicéridos son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos mediante la lipoproteinlipasa. El glicerol así producido se determina en forma totalmente enzimática por medio de una secuencia reaccional que incluye su fosforilación a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerokinasa y la oxidación del derivado fosforilado mediante glicerol fosfato oxidasa, con producción de agua oxigenada. A su vez, esta última produce la copulación oxidativa del clorofenol y la 4-aminofenazona, catalizada por la peroxidasa con formación de una quinonimina roja que absorbe a 505 nm. TEcnica operatoria Muestra:
Material requerido:
Reactivos: Entre los distintos reactivos comerciales pueden diferir las concentraciones de las enzimas. En el TP se usará TG Color GPO/PAP de Wiener.
Glicerokinasa Glicerol fosfato oxidasa Peroxidasa Reactivo 4 - AF Reactivo ATP
Reactivo de Trabajo: Según las instrucciones del fabricante reconstituir el vial liofilizado con buffer, mezclar hasta disolución completa. Homogeneizar y fechar. Estable 1 mes en refrigerador. Desechar cuando las lecturas del Blanco superen 0,160 D.O. o las del Testigo sean anormalmente bajas. Procedimiento Homogeneizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos. En tubos rotulados colocar: Blanco Testigo Muestra Testigo 10 ul Suero 10 ul Reactivo de trabajo 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar. Incubar 10 minutos a 37 °C. Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). Color estable 1 hora. Cálculos: factor = 200 mg/dl / Absorbancia del Testigo Triglicéridos (mg/dl) = Absorbancia de la Muestra x factor Control de Calidad Interno: Pueden utilizarse sueros comerciales Standatrol 2 niveles (Wiener), Precinorm-Precipath (Roche) y/o pool de sueros preparado en el laboratorio obteniendo los estadísticos propios. Control de Calidad Externo: Participar de Programas Interlaboratorios reconocidos. Performance del mEtodo (WIENER):
Bibliografia Gradwohl- Sonnerwirth- Jaret "Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico" 8ª Edición 1983. Capítulo 9. Editorial Panamericana. Pesce - Kaplan "Química Clínica. Métodos". Edición 1990. Editorial Panamericana. Todd - Sanford "Diagnóstico clínico por el laboratorio” I. Davidson y J. B. Henry. Editorial Salvat. Alfonso Balcells "La Clínica y el Laboratorio". 17ª Edición, 1997.Editorial Masson S.A. Barcelona (España). Oberman, A. y otros “Fundamentos y Manejo de los Trastornos Lipídicos” 1993. Editorial Médica Hispanoamericana. Vademécum Laboratorios WIENER. |
