Instrucciones para el trabajo en el laboratorio de Química Orgánica




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títuloInstrucciones para el trabajo en el laboratorio de Química Orgánica
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fecha de publicación24.11.2015
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Reacción de la Ninhidrina para aminoácidos



Entre las principales reacciones de identificación de los aminoácidos se encuentra la reacción con la ninhidrina. Esta reacción es útil para detectar y cuantificar aminoácidos en cantidades del orden del microgramo.

Fundamento: Los  aminoácidos en general reaccionan con ninhidrina en presencia de calor dando dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído. La reacción da lugar a la formación de un complejo de color azul o púrpura (= 570 nm), que es útil para la estimación cualitativa y cuantitativa de los aminoácidos. Los iminoácidos prolina e hidroxiprolina, producen un color amarillo con este reactivo.
Determinación Cualitativa: Impregnar una tira de papel de filtro con la solución de gelatina hidrolizada que contiene aminoácidos y secar. Mojar posteriormente con ninhidrina y llevar a estufa a 100 ºC.

La aparición de un color azul indica un resultado positivo para alfa-aminoácidos, un color amarillo indica la presencia de prolina y/o hidroxiprolina y la asparagina, que tiene un grupo amido en la cadena lateral, origina un color café. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.
Advertencia: la Ninhidrina es un producto combustible y nocivo por ingestión. Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias.

Enzimas: CATALASA



Triturar en un mortero 5 gr de papa, agregar luego 30 ml H2O destilada y centrifugar, para separar las enzimas que quedaran en el líquido sobrenadante.

Efecto de la Temperatura


En tres tubos marcados con: calor, frío y temperatura ambiente, colocar 3 ml de la solución de enzima en cada tubo.

1- Colocar el tubo marcado como “calor” en un baño de H2O caliente por tres minutos.

2- Colocar el tubo marcado como “frío” en un baño de hielo por tres minutos.

3- Dejar el tubo marcado a “Temperatura ambiente” en la gradilla por tres minutos.
Después de este tiempo, agregar H2O2 al 3% (aproximadamente 10 volúmenes) a cada tubo. Incubar la mezcla durante 1 minuto y anotar la altura en cm, de la espuma que producen las burbujas de O2 desprendidas.

Medir el radio del tubo en cm y anotar.

Efecto del pH

En tres tubos marcados con: ácido, base y agua, colocar 3 ml de solución de catalasa en cada tubo.





  1. Agregar diez gotas de HCl al tubo denominado “ácido”

  2. Agregar 10 gatas de NaOH 1M al tubo con la denominación “base”.

  3. Agregar 10 gotas de H2O al tercer tubo. Mezclar muy bien y esperar dos minutos. Luego agregar 3 ml de H2O2 a cada tubo.

Incubar la mezcla durante 1 minuto a temperatura ambiente y medir la altura de las burbujas en cm. Medir el radio del tubo de ensayo y anotar. Realizar los cálculos correspondientes con la ecuación:  r2h. Anotar los cálculos en las tablas 1 y 2.
Tabla 1. Efecto de la Temperatura sobre la acción de la catalasa







Altura de las burbujas (cm)

Radio del tubo de ensayo (cm)

Volumen de reacción (cm3)

Calor









Temperatura ambiente










Frío










Tabla 2. Efecto de pH sobre la acción de la catalasa





Altura de la espuma (cm)

Radio del tubo de ensayo (cm)

Volumen de reacción (cm3)

Ácido











Agua










Base











TRABAJO PRÁCTICO Nº 8: ACIDOS NUCLEICOS: AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE TIMO.
Objetivos
1) Separar el ácido desoxirribonucleico del ácido ribonucleico a partir de un tejido animal, a través de sus propiedades diferenciales de solubilidad.
2) Obtener el ADN puro por precipitación.
Introducción

El Acido Desoxirribonucleico (ADN) y el Acido Ribonucleico (ARN), son macromoléculas catenarias que actúan en el almacenamiento y en la transferencia de la información genética. Son componentes celulares. Se encuentran en el núcleo, mitocondrias, cloroplastos y parte en el citoplasma.

Están presentes en los virus, que son complejos de proteínas y ácidos nucleicos infecciosos capaces de dirigir su propia replicación al infectar a una célula huésped específica. Los ácidos nucleicos son sólidos, incoloros.

NUCLEÓTIDOS

Son las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos, al igual que los aminoácidos son las unidades monoméricas de las proteínas.

Los desoxirribonucleótidos son las unidades monómeras del ADN.

Los ribonucleótidos son las unidades monómeras del ARN.

Cada nucleótido tiene:

- Una base nitrogenada heterocíclica, que es un derivado de la purina o de la pirimidina.

- Una pentosa : ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN)

- Una molécula de Acido fosfórico.



Nucleótido de ARN Nucleótido de ADN

Figura 1



BASES NITROGENADAS

Son cinco. Son derivados de:

PURINA PIRIMIDINA







Las bases nitrogenadas del ADN son: Adenina-Timina, Citosina-Guanina.

Las bases nitrogenadas del ARN son: Adenina-Uracilo, Citosina-Guanina.

Los nucleótidos difieren entre sí por las bases nitrogenadas.




PENTOSAS:

Los desoxirribonucleótidos contienen la 2-desoxi-D-ribosa, que existe en el ADN .

La D-ribosa es la pentosa del los ARN.

Ambas pentosas se encuentran en la forma furanosa.

La combinación de una base (púrica o pirimidica) con un azúcar (ribosa o desoxirribosa) da lugar a un NUCLEOSIDO.

La combinación de un nucleósido con el ác. fosfórico produce un NUCLEOTIDO (o sea que son fosfatos de nucleósidos) (Fig 1)

NUCLEOSIDO



FOSFATO + PENTOSA + BASE NITROGENADA



NUCLEOTIDO

La pentosa está unida a la base por un enlace -N glucosilo, establecido entre el átomo de carbono 1 de la pentosa y el átomo de nitrógeno 9 de las bases púricas, o el átomo de nitrógeno 1 de las bases pirimidínicas.

El grupo fosfato de los nucleótidos se halla unido por medio de un enlace éster al átomo de carbono 5 de la pentosa.

ADN



Se presenta como dos hebras, en un ordenamiento duplohelicoidal pero también puede existir en la naturaleza en forma de cadenas sim­ples. En los procariontes, que presentan un solo cromosoma, todo el ADN está en forma de una sola doble hélice, en los eucariontes que tienen muchos cromosomas, hay muchas moléculas de ADN.

En los procariontes (bacterias) el ADN no está ligado a proteínas y está en la zona nuclear ligado por un punto a la membrana celular.

En los eucariontes el ADN está ligado mediante enlaces iónicos a proteínas llamadas HISTONAS (proteínas básica) y se encuentran en el núcleo, cloroplastos y mitocondrias.

ARN

Los ARN en general se presentan como cadenas simples. Existen tres tipos de ARN

- ARN MENSAJERO (mARN): Se forma a partir de ADN por un proceso llamado transcripción, en donde la secuencia de bases de la hebra del mARN es complementaria de la del ADN que fue transcripta. Desde el núcleo pasa al citoplasma donde entregará la información para síntesis de proteínas

- ARN DE TRANSFERENCIA (tARN): Actúan como transportadores de aminoácidos individuales durante la síntesis de las proteínas. Cada uno de los 20 aminoácidos posee por lo menos un tARN.

  • ARN RIBOSOMICO (rARN): Constituye el 65% de la masa de los ribosomas (los ribosomas están formados por ribonucleoproteínas).

  • ARN catalítico (RIBOZIMAS): son enzimas de naturaleza nucleotídica no proteica que se presentan en el proceso de maduración de ARNm.

Tanto el ADN como el ARN presentan a los nucleótidos unidos covalentemente por puentes fosfodiéster entre el grupo 5'-hidroxilo de un nucleótido y el 3'-hidroxilo de siguiente. Así el esqueleto de ADN y ARN está constituído por grupos alternados de fosfatos y pentosas. Las bases púricas y pirimidínicas constituyen cadenas laterales difer­enciadas.

PARTE EXPERIMENTAL

AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA
Una fuente adecuada para la obtención del ADN debe reunir ciertos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:
1) Elevada concentración de ADN.

2) Mínima relación ARN/ADN

3) Baja actividad de ADNasa.

4) Elevado contenido ADN/órgano.

5) Fácil disponibilidad.

6) Bajo costo.

El timo de ternera, conocido vulgarmente como “falsa molleja” reúne todos estos requisitos.
El método elegido consta de los siguientes pasos:


  1. Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-pro­teína).

  2. Disociación del complejo en sus dos componentes : DNA y pro­teínas.

  3. Eliminación de las proteínas.

  4. Precipitación del desoxirribonucleato de sodio.

I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO
Pesar 15 gr. de timo en una cápsula de Petri y cortar con un cuchillo o navaja en láminas delgadas; colocar el tejido desmenuzado en un vaso homogeneizador de 100 ml de capacidad y se le agregar 45 c.c. de citrato de sodio 0,015 M y 45 c.c. de cloruro de sodio 0,15 M. Tomar el pH y elevar a pH 7 con Tris. Colocar la mezcla en licuadora y presionar el botón de máxima velocidad durante 3 minutos. Se obtiene una suspensión de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.
Centrifugación:
Verter el homogeneizado en tubos de centrífuga y centrifugar en frío (5ºC) durante 5 minutos a 5.000 r.p.m.. Se obtiene un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.

II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO:
Colocar en un Erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y agregar 30,75 ml de Citrato de Sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml. de solución de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 5% en etanol al 45%. Sucesivamente agregar siguiendo el orden que se indica y mezclar bien después de cada adición, 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml. de ClNa 2 M y 3,78 ml de Citrato de Sodio 0,015 M (para completar 105 ml.)
III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:
En una ampolla de decantación colocar la suspensión obtenida y agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsión resultante en tubos de centrífuga y se centrifuga en frío (5ºC) du­rante 10 minutos a 5000 r.p.m. Retirar los tubos suavemente de la centrífuga para mantener la separación de las fases. Con una pipeta

capilar retirar la capa acuosa superior que contiene la sal de sodio del DNA tratando de no perturbar la fase proteica.
IV-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO:
En un recipiente de telgopor colocar hielo picado y sobre el mismo, un vaso de precipitación que contiene la capa acuosa despro­teinizada. Medir dos volúmenes de etanol al 95% frío y verter lenta­mente sobre las paredes del vaso tratando de formar una capa alcohóli­ca sobre la fase acuosa viscosa. Con una varilla de vidrio gruesa agitar la solución de ADN con un movimiento de rotación suave y conti­nuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla.

Cuando el etanol se vuelve límpido, signo de que ya se ha enros­cado todo el ADN, retirar la varilla del líquido y presionar las fibras de ADN sobre las paredes del vaso de precipitación para expri­mir el exceso de solvente.

Eliminar el líquido residual apoyando la varilla sobre un papel de filtro. Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga éter etílico. Retirar el ADN de la varilla y colocar en un vidrio de reloj dejar secar 10 minutos para eliminar por completo el solvente.


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