La separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox
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| CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CROMATOGRAFÍA INTRODUCCIÓN La cromatografía es una técnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia. Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a través de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett utilizó como detector del experimento la simple observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas. A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier técnica que se base en los mismos principios. La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un sólido común donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos BASE CIENTÍFICA En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox. Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la separación de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos según el mecanismo de separación: •Cromatografía de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad. •Cromatografía de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción. •Cromatografía de exclusión: separa solutos según el peso molecular. •Cromatografía de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica. También se pueden clasificar según el estado de la fase móvil en : •Cromatografía de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas:
•Cromatografía líquida: la fase móvil es un líquido y puede ser: C. liquido-liquido C. liquido-sólido C. de exclusión C. de intercambio ionico Las únicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografía son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las técnicas cromatográficas no se incluyen los métodos que utilizan campos eléctricos para separar moléculas cargadas, métodos que se denominan electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis. El proceso cromatográfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unión de fenómenos tales como hidrodinámica, cinética, termodinámica, química de superficie y difusión. Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, que incluyen complejos matemáticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas, por citar alguna de estas teorias las más estudiadas son: Teoría de los Platos Teóricos (Martin & Synge). Teoría Cinética (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer). Teoría Desarrollada para Columnas Capilares (Golay). TERMINOLOGÍA EN CROMATOGRAFÍA Absorción: es la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma. Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto. Adsorción: Es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retención superficial puede ser física o química. C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar. Disolvente o revelador: Cualquier fase móvil. Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria. Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna. Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte. Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria. Origen : Lugar físico donde se coloca la muestra al principio. Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía. Soporte: El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio. Sorbente: Cualquier fase estacionaria. Cromatograma Además de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas continuamente para obtener una información global del proceso pasando la muestra a través de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector se sitúan al final de la columna. El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa por él, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de gráfica, ésta gráfica que recoge la respuesta del detector en función del tiempo se denomina cromatograma. En las graficas se observa la aparición de una serie de picos a lo largo del tiempo, generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la concentración de analitos en la fase móvil, la forma de cada pico muestra la distribución de concentración del componente asociado a dicho pico. En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo equivalente. En la cromatografía moderna es frecuente mantener constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo), así mediante esta relación se puede reflejar el tiempo en el eje horizontal: velocidad de flujo x tiempo = volumen La cromatografía líquida puede llevarse a cabo por cuatro técnicas analíticas: CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA • C. En papel • C. En capa fina •C. en columna •C. Líquida de alta resolución – HPLC – CROMATOGRAFIA EN PAPEL Es una forma combinada de cromatografías de partición y adsorción en la que la fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel mismo. La fase móvil es una solución que consiste de un solvente o de una mezcla de varios líquidos, incluyendo el agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del extracto de la muestra y se forma una mancha. Para impedir la evaporación, el papel se cuelga dentro de una cámara de tal forma que la mancha pueda ser irrigada con la fase móvil ya sea hacia abajo por efecto de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad. Cuando la fase móvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en la que se logre la separación cromatográfica, se saca el papel de la cámara y se desarrolla el cromatograma rociando agente reveladores. En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la separación resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no polares también pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no polar y usando solventes polares como fase móvil. Es una técnica barata pero relativamente lenta, con limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de los cuales pueden atacar y destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC) Es un procedimiento rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes individuales. La separación se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra móvil: en la TLC el eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción. Al contrario, que en la cromatografía en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea así para su identificación. Las separaciones se realizan generalmente por el “procedimiento ascendiente”, introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa. Aparatos y materiales. Generalidades - Cubeta cromatográfica (con tapa hermética); la mayoría de las veces se trata de la cubeta “Normal” (profundidad del espacio para el gas: 3mm) - Placas de cromatografía: preparadas por uno mismo o ya fabricadas. - Pipetas de microlitro - Recipiente de vidrio con pulverizador - Probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase móvil) - Secador - Plantilla para TLC o regla - En caso necesario: lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminución de la misma. Placas cromatográficas y sorbentes Las placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, láminas de aluminio o de fibra) sobre las que se dispone el sorbente formando un espesor lo más homogéneo posible (por lo general 0,25 mm); dependiendo de la separación a realizar, se tratará de silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, etc o mezclas. En tanto que en el HPLC se utilizan principalmente materiales de fase inversa, en la cromatografía en capa fina predominan los materiales para fase normal, como por ejemplo el sílica gel. Hay placas de TLC que tienen la denominada zona de concentración (=zona de carga). Se trata de una zona de unos 2 cm de anchura de barro de diatomeas o de un gel de sílice de tamaño de poro muy grande, de manera que durante el desarrollo de la placa de TLC en esa zona prácticamente no hay separación cromatográfica. La ventaja específica es que los componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la línea de partida (línea divisoria entre la zona de concentración y sorción). Así resulta posible cargar grandes volúmenes y obtener una buena separación. Carga de las disoluciones Las disoluciones de la muestra y de los patrones se cargan con pipetas de microlitro (o similares) sobre la placa de TLC, de manera que el punto medio de la mancha esté a 1.5 cm aproximadamente del borde inferior y de los bordes de los laterales y que haya una separación entre 1-2 cm de una mancha a otra (Fig: A). Los volúmenes recomendables dependen de la concentración de las disoluciones. Por lo general, se cargan 1-10 microgramos de sustancia por mancha. Si la concentración de la sustancia a analizar fuera de un orden de magnitud desconocido, la muestra debería cargarse varias veces en volúmenes crecientes y claramente diferentes. Los volúmenes mayores se cargan en varias veces, secando entre una y otra (con aire frío o caliente, aire a presión o con nitrógeno), para evitar que las manchas se extiendan. Para realizar determinaciones cuantitativas con placas convencionales, se cargan volúmenes aproximados de 0.5-1.0 microlitros por mancha. Los volúmenes mayores de 5.0 microlitros deben evitarse salvo en casos excepcionales, donde se cargaran en varias veces. Desarrollo El eluyente, cuya composición depende de cada problema concreto, se pone en la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separación hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrará con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para que la saturación sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicará en el protocolo en el caso que sea necesario). Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas cargadas deberán estar completamente por encima del nivel de eluyente. El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a través del recubrimiento. El recorrido será, dependiendo de la separación, de 5 a 15 cm máximo, y el tiempo necesario dependerá del sorbente, del espesor del mismo y de la composición del eluyente. El recorrido óptimo es por lo general de 10 cm. Cálculos Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posición de las manchas se determina: -por su color propio -por su fluorescencia -por la disminución o amortiguación de la fluorescencia -por reacción química: la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o una fluorescencia particular. La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf (factor de retención , llamado también factor Rf o hRf (=Rf x 100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente (lL). Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tinción (si es posible en el mismo cromatograma). Como control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos (la disolución problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma mancha). Cromatografía bidimensional en capa fina Para mejorar una separación incompleta, se combinan dos pasos de cromatografía mono dimensional de la manera siguiente: 1º paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido ascendente como se describía más arriba. 2º paso: girar 90º la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuación se desarrolla en sentido ascendente con un segundo eluyente. La investigación y la determinación se realizan como ya han sido descritas anteriormente. Aplicaciones En la mayoría de los casos la TLC se realiza cuando se quieren hacer evaluaciones cualitativas rápidas (screening). Las determinaciones cuantitativas son posibles por acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de carga, scanner); en estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque son más efectivas. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Fue la forma original de cromatografía líquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van desde la alúmina, gel de sílice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintéticas y derivados polisacáridos. Se usan todos los tipos de cromatografía líquida. Lo habitual es que la fase móvil se deje percolar a través de la columna por gravedad. No se usa mucho en el análisis de alimentos ya que es una técnica para la separación cromatográfica de mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en día existe un sistema cromatográfico completo y automático diseñado para el análisis bioquímico que se conoce como “cromatografía líquida rápida para proteínas”. Estos instrumentos emplean un rango de fases en columnas de plástico de 5 o 10 cm que operan bajo presión moderada. Se revolucionó el uso de la cromatografía en columna para la purificación de soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones, debido a la introducción de cartuchos cortos de plástico y desechables de mini columnas, preempacados con una variedad de fases de separación con partículas de tamaño relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y Sep-Pak. Las soluciones de prueba, de lavado o extracción pasan rápidamente a través de los cartuchos con un poco de vacío generado a través de una bomba de agua. La mayoría de los métodos de purificación tales como la extracción líquido-líquido, la TLC y la cromatografía en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometría, la GLC, la HPLC etc…, pueden ahora realizarse en forma más eficiente usando estos cartuchos. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases. Se lleva a cabo una cromatografía líquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografía en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase móvil es relativamente polar. Hay cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido: -Cromatografía de reparto, para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular < 104g/ mol. -Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografía de intercambio iónico, para especies iónicas de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles, para solutos con masa molecular >104 g/mol. Laelución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y estacionaria. Adicciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx) Referencias bibliográficas Conceptos básicos sobre cromatografía. Recuperado de http://www.geocities.ws/todolostrabajossallo/orgaI_9.pdf |
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