Las proteínas son biomoléculas formados por 20




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Química Biológica 2010

Química Biológica

TP 4 PROTEINAS , .
Introducción



Las proteínas son biomoléculas formados por 20 L--aminoácidos distintos, unidos linealmente entre sí por enlaces peptídicos, en un número que varía entre 50 a más de 1000. Los aminoácidos como su nombre lo indica son moléculas que se caracterizan por presentar, al menos, un grupo ácido y un grupo amino.


Formula general de un aminoacido


Los distintos aminoácidos se diferencian en la estructura del grupo R, en la naturaleza de dicha cadena lateral se basa la clasificación de los aminoacidos. La presencia de un grupo amino y otro ácido determina que los aminoácidos se comporten como bases o como ácidos dependiendo el pH del medio. El valor de pH al cual el aminoácido no tiene carga neta se llama punto isoeléctrico (pI), a valores de pH < pI la molécula tendrá carga positiva mientras que la carga será negativa si pH > pI. La forma neutra se debe a la formación de una sal interna llamada Zwitterion, esto ocurre porque el protón del grupo carboxilo es abstraído por el grupo amino NH2 que está en posición alfa y quedando este como grupo amonio NH3+

El punto isoeléctrico de las proteínas esta influenciado por las cadenas laterales, ya que los grupos aminos y acidos principales participan en el enlace peptídico
Las proteínas presenta numerosas funciones: actividad enzimática, de transporte, hormonal, contráctil, reserva energética, estructurales etc. Según su conformacion nativa las proteinas pueden clasificarse en Fibrosas o Globulares:

  • Fibrosas:

- típicas estructuras secundarias, formadas por fibras ordenadas a lo largo de un eje.

- insolubles en agua y en soluciones acuosas.

- gran resistencia física: acción mecánica (esqueletos, transmisión de esfuerzos) o protección.

Ej: esclerotina, colágeno, elastina, queratina.


  • Globulares:

- cadenas plegadas de tal modo que toman formas esféricas o globulares compactas (estructura terciaria).

- solubles en agua o soluciones acuosas.

- papeles muy dinámicos en el organismo. Pertenecen a esta categoría, las enzimas, los anticuerpos, algunas hormonas, las proteínas con función de transporte, etc.
Algunas proteínas no se encuentran claramente en ninguno de estos grupos de clasificación: por ejemplo, pueden presentar estructura de tipo fibroso, pero ser solubles en soluciones salinas, como las globulares, que es el caso de la miosina del músculo y el fibrinógeno del plasma sanguíneo.
Según su composición química, las proteínas pueden ser:

Simples: su hidrólisis produce sólo aminoácidos, como la insulina o el colágeno.

Conjugadas: su hidrólisis produce, además de aminoácidos, otros compuestos inorgánicos u orgánicos, clasificándose entonces en:

  • Nucleoproteínas.

  • Fosfoproteínas.

  • Glicoproteínas.

  • Metaloproteínas.

  • Lipoproteínas.


Parte experimental

Objetivos:

- Reconocer distintos agentes desnaturalizantes

- Caracterizar los aminoácidos de la albúmina

- Cuantificar proteínas solubles en distintas muestras biológicas
Desnaturalización
Es la modificación que ocurre en la estructura nativa de una proteína, alterando así sus propiedades. Envuelve alteraciones de la estructura 2°,3° y 4° de las proteínas. La estructura 1° se mantiene. Las alteraciones que se observan son disminución de la solubilidad y/o pérdida de la actividad biológica. La disminución de la solubilidad puede ser explicada por la exposición de radicales hidrofóbicos que perjudican la interacción proteína-agua y favorecen la interacción proteína-proteína. La floculación y la coagulación son manifestaciones visibles de la alteración estructural causada por agentes desnaturalizantes.
Agentes desnaturalizantes:
Calor: la agitación térmica afecta las interacciones que estabilizan la estructura tridimensional de las proteínas (puentes H, interacción hidrofóbica)
Ácidos: se combinan con proteínas con carga + formando complejos proteínatos insolubles
Sales de metales pesados: se combinan con proteinas de carga formando proteinatos insolubles.
Solventes orgánicos: presentan cte dieléctrica inferior al agua entonces la atracción entre cargas opuestas es alta.(precipitación)
Coagulación

  1. Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo y agregar igual cantidad de agua

  2. Añadir 8 gotas de ácido acético.

  3. Repetir en otro tubo el paso 1 y calentar suavemente.

  4. Observar e interpretar los resultados

Prueba de Sulfato de amonio
Las proteínas, como otros coloide son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de agregación y precipitación.

1. Poner en el tubo de ensayo de 1 ml de albúmina de huevo

2. Añadir 1 ml de solución de sulfato de amonio al 50%.

3. Mezclar, dejar en reposo 10 min. y observar la formación de precipitado.

Caracterización de aminoácidos de la albúmina

Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados.

Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos de esas proteínas y son importantes tanto para la detección como para el dopaje de aminoácidos y proteínas.

Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a todas las proteínas como grupos amino o uniones peptídicas (ninhidrina y biuret)

Reacción Xantoproteica

Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina, triptofano. Una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali y vira a un color anaranjado.

  1. Poner en el tubo de ensayo de 2 ml de clara de huevo.

  2. Agregar un volumen igual de agua destilada.

  3. Añadir 1 ml de HNO3 concentrado.

  4. Calentar al Baño María a 100 C

  5. Enfriar en agua fría

  6. Añadir gota a gota una disolución de Hidróxido de sodio al 40%.

Reacción de aminoácidos azufrados

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.

  1. Poner en el tubo de ensayo de 2 ml de clara de huevo.

  2. Agregar un volumen igual de agua destilada.

  3. Añadir 2 ml de solución de hidróxido sódico al 20%.

  4. Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.

  5. Calentar el tubo hasta ebullición.


Determinación cuantitativa de proteínas mediante el método de Biuret.


Este método es sencillo y su sensibilidad está dentro de un rango de concentración del orden de miligramos. Emplea el reactivo de Biuret: sulfato de cobre en medio alcalino. EDTA/Cu en hidróxido de sodio. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, que en contacto con una solución de sulfato cúprico da una coloración violeta característica. La reaccion se basa en la formación de un complejo azul debido a la unión del sulfato de cobre en medio alcalino con compuestos con 2 o más uniones peptídicas.

Complejo Biuret

Actividades
Pesar 1 g de material biológico: hígado, pollo y carne. Homogeneizarlo en un Potter con 10 ml de agua destilada. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm. Separar el sobrenadante. (muestra)






Blanco

Testigo

Problema

Agua destilada

0,1 ml

--

--

Sobrenadante

--

--

0,1 ml

Testigo 3 g %

--

0,1 ml

--

Biuret

3 ml

3 ml

3 ml


Incubar 30 minutos a t ambiente y leer a 540 nm, llevando a 0 con el tubo blanco.

Calcular la concentración del problema en g % de proteínas solubles.

Calcular el % p/p en cada material biológico.

Actividades complementarias

  1. Indica la estructura de los siguientes aminoácidos:

    1. Un AA básico

    2. Un AA ácido

    3. Un AA Neutro no polar

    4. Un AA Neutro polar

  2. Define proteína

  3. Indica proteínas que cumplan las siguientes funciones:

    1. Contráctil:

    2. Estructural

    3. Hormonal

    4. Transporte intracelular

    5. Enzimática

4.Define estructura 1º, 2º, 3º y 4º


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