Los métodos más usados en la separación de moléculas son la ultracentrifugación, la electroforesis y la cromatografía (Cardella-Hernandez, n d.). Esta técnica




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CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

INTRODUCCIÓN

Los métodos más usados en la separación de moléculas son la ultracentrifugación, la electroforesis y la cromatografía (Cardella-Hernandez, n.d.). Esta técnica incluye una serie de métodos analíticos de separación que tienen como característica general el de estar constituidos por una fase estacionaria y una fase móvil, entre las que se distribuyen diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase móvil, la que arrastra a las partículas que se van a separar, es un liquido (solvente o mezcla de solventes) se denomina cromatografía de líquidos. Si la fase móvil es un gas se denomina cromatografía de gases (Gonzales et al, 2008).

La cromatografía en papel (cromatografía en la que la fase estacionaria es papel), es una técnica en la que se aplica un pequeño volumen de la muestra cerca de uno de los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografía puede ser ascendente, en la que el papel se sujeta a la parte superior de la cámara y se sumerge en el solvente, que se encuentra en el fondo, entonces el solvente se mueve hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separación, los solutos de la mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo de la solubilidad en el solvente. La relación de migración de una sustancia (Rf) puede expresarse de acuerdo con la siguiente fórmula (Gonzales et al, 2008):



La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas pequeñas como lípidos, nucleótidos, vitaminas, fármacos y aminoácidos; debido a que cada sustancia exhibe un valor Rf particular, es posible separar aminoácidos y péptidos, ya que estos presentan características particulares, de solubilidad, polaridad y tamaño, por la composición química de sus grupos R (Koolman & Roehm, 2005).

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema mediante su Rf, y ver sus propiedades de solubilizacion comparándolo con los Rf de los aminoácidos que los componen.

OBJETIVOS PARTICULARES

  • Separar aminoácidos y péptidos mediante el uso de la cromatografía en papel.

  • Determinar el corrimiento cromatográfico de un aminoácido polar y uno no polar, comparando el Rf de cada uno de ellos.

  • Separar e identificar, por medio de la cromatografía en papel, el aspartame presente en un refresco dietético, comparando su Rfcon el del Canderel.

HIPÓTESIS

Si se utiliza la técnica de cromatografía es posible separar las sustancias en sus componentes esenciales.

MATERIAL Y MÉTODO

Primero, se recortó un rectángulo de papel de whatman con medidas de 20x9cm con guantes de látex puestos para no contaminarlo. Enseguida se coloco encima de un pliego de cartulina para su fácil manipulación.

Después, se marcaron seis puntos sobre el papel, los cuales se colocaron a un centímetro de la base del papel y a unos 0.5 cm entre punto y punto, aproximadamente. Posteriormente, en los espacios comprendidos entre cada punto se pusieron las muestras de cinco sustancias diferentes: Fenilalanina, Acido Apartico, Canderel, Refresco Normal (sin colorante) y Refresco de Dieta (sin colorante).

Estas muestras se tomaron con un capilar para cada substancia y se pusieron cinco gotas de cada solución entre cada espacio del papel (entre cada aplicación de las muestras se secaba con una secadora).

Después se coloco dentro de la cámara para cromatografía que tenía una mezcla eluyente de Butanol, Acido Acético y agua, que se encontraba dentro de la campana de extracción con una parrilla magnética con una temperatura de 250C, ahi se dejo por una hora y media aproximadamente.

Después se marcó con un lápiz hasta donde llego la fase móvil en el papel de whatman, enseguida se dispuso a dejar secar dentro de la campana de extracción y con una parrilla eléctrica se mantenía la temperatura deseada.

En el momento en el que se seco se aplico ninhidrina con un atomizador para poder revelar el lugar donde se encontraban las muestras, solo hasta donde se marco con el lápiz.

RESULTADOS

En el corrimiento cromatográfico (figura 1) se observan 5 bandas teñidas de color purpura correspondientes a las 5 muestras utilizadas, en las cuales es posible identificar manchas de diferentes tamaños y a diferentes distancias.


Figura 1: Corrimiento cromatográfico. De izquierda a derecha: Fenilalanina, ácido aspartico, refresco dietético y no dietético y Canderel. Pueden observarse manchas de diferentes tamaños y distancias recorridas diferentes, lo que permite calcular el Rf de cada una de ellas.

De acuerdo a la relación de migración para las sustancias aquí utilizadas (aminoácidos, refrescos y canderel) se obtuvieron los valores de Rf para cada una de ellas utilizando la fórmula siguiente:



Como la distancia recorrida por la mezcla eluyente fue de 8.8 cm y las distancias recorridas por las muestras fueron diferentes, los Rf quedan:

Tabla 1: valores de Rf para las muestras de aminoácidos, refrescos y canderel

Muestras

Distancia recorrida por la mezcla eluyente

Distancia recorridas por las muestras

Rf de las muestras

Fenilalanina

8.8 cm

7.0 cm

0.7955

Acido aspártico

1.5 cm

0.1705

Refresco dietético

1 cm

3 cm

0.113636

0.340909

Refresco no dietético

2.5 cm

0.2840

Canderel

3cm

8 cm

0.340909

0.909090

R.F. de la sustancias trabajadas en el laboratorio

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Ninguna muestra estudiada presentó el mismo Rf, ya que la tendencia relativa de las moléculas en la mezcla (aminoácidos) para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase no es la misma (Murray et al, 2007).

Aunque las muestras de canderel (aspartame, compuesto formado por fenilanina y acido apartico) y del refresco dietético no tengan precisamente el mismo Rf, estas presentan la misma tendencia a disociarse en dos manchas, la mancha con un valor mayor de Rf parece ser la fenilalanina y la otra el ácido aspártico, tal como lo muestran las dos primeras columnas de la imagen 1 del corrimiento cromatográfico para la fenilalanina y el ácido aspártico, respectivamente. Puesto que los dos tipos de refresco no presentan el mismo Rf, ni el patrón de disociación es el mismo, queda determinado que el aspartame está presente en el refresco dietético, no así en el refresco normal.

CONCLUSIÓN

Debido a que cada sustancia exhibe un Rf característico, diferente a las demás, debido a sus propiedades de solubilizacion, es posible la separación de aminoácidos presentes en muestras problema, como la fenilalanina y ácido aspártico, en forma de aspartame, presentes en los refrescos dietéticos, mediante la técnica de la cromatografía en papel.

BIBLIOGRAFÍA

  • Cardella-Hernández. Bioquímica médica, tomo I: Biomoléculas. n.d.

  • González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de León-Sánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de bioquímica 1. 3ª ed. México.

  • Koolman, J. & K.H. Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2ª edición. Thieme. New York. EU.

  • Murray, R. K.; D.K. Granner; V.W. Rodwell; P.A. Mayes (2007) Harper. Bioquímica ilustrada. 14ª ed. México, Manual Moderno

ANEXO (CUESTIONARIO)

1.- ¿que son la fase estacionaria y la fase móvil de un sistema cromatografico?

La fase estacionaria de una cromatografía, consta de un sólido o un líquido adherido a un sólido, por el cual se hace pasar un fluido.

La fase móvil de una cromatografía, consta de un líquido o un gas que es capas de moverse a través de la fase estacionaria, a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

2.- ¿como se puede modificar la fase móvil de un sistema cromatografico?

Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografía, la fase móvil debe elegirse de forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se produzca una acumulación en la base de la cromatografía.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

3.- ¿Qué es el Rf de una sustancia?

Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia desde el origen y la distancia recorrida del eluyente.

El Rf es una cifra útil porque es constante cuando se reproduce el experimento en todas las condiciones además de ser tan característico y descriptivo de un compuesto como puede serlo el punto de fusión. Por supuesto, el Rf de un compuesto dado será diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una ventaja, puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más específicamente registrando sus Rf en varios disolventes.

Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentración del ambiente de la cámara y la temperatura.

Cromatografía sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

4.- investigue las características de los aminoácidos utilizados en esta práctica y como se clasifican.

Aminoácidos Esenciales vs. No Esenciales

No esenciales

Esenciales

Alanina

Arginina*

Asparagina

Histidina

Aspartato

Isoleucina

Cisteina

Leucina

Glutamato

Lisina


*Los aminoácidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por razones no directamente relacionadas por la falta de síntesis. La arginina es sintetizada por las células de mamíferos pero en un rango que es insuficiente para resolver las necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayoría que es sintetizada es procesada para formar urea. La metionina es requerida en grandes cantidades para producir cisteina, si el último aminoácido no es provisto adecuadamente en la dieta. Igualmente, la fenilalanina se necesita en grandes cantidades para formar tirosina, si este último aminoácido no es adecuadamente provisto en la dieta.

La fenilalanina: Es un aminoácido esencial aromático (junto con el triptófano y la tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencénico (Ruta 2). Uno de los aspectos más relevantes de su biosíntesis es el mecanismo a través del cual los anillos aromáticos se forman a partir de precursores alifáticos. También se le clasifica, junto con el triptófano, como un aminoácido hidrofóbico con estructura cíclica. Según los últimos estudios sobre los aminoácidos esenciales parece que en la fenilalanina, la estructura carbonada sería su parte considerada esencial ya que esta estructura es transaminada con rapidez por el organismo.

La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilación, en tirosina que es otro aminoácido, en este caso considerado como semiesencial.

Además la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si bien acortamos el mecanismo en la síntesis de catecolaminas utilizando la tirosina como precursor (ver Ruta 3). También es un constituyente importante de los neuropéptidos cerebrales, como la somatostatina, vasopresina, melanotropina, encefalina, ACTH, angiotensina, sustancia P y colecistoquinina. Muchas drogas de las que conocemos como psicotrópicas, contienen fenilalanina.

La fuente más importante de fenilalanina son los alimentos ricos en proteínas, como es la carne y los productos lácteos. La fenilalanina tiene utilidades en la industria de la alimentación, por ejemplo, en la elaboración de edulcorantes artificiales.

Acido aspártico: Aminoácido glucogénico (puede convertirse en glucosa y glucógeno) cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un compuesto muy hidrofílico, y como tal se encuentra casi siempre en la superficie externa de las proteínas globulares. Es un compuesto metabólicamente activo debido a su interconversión con los ácidos dicarboxílicos tetracarbonados del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, después de sufrir una transaminación. Es el precursor de la asparagina. También interviene en otras reacciones como dador de aminos en la síntesis de urea y de purinas, y como precursor de los anillos pirimidínicos a través de la formación de carbamoilaspartato en el citosol. Es, junto con el glutámico, el principal neurotransmisor excitatorio de la corteza cerebral.

http://www.biopsicologia.net/fichas/page_592.html

http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/amino-acid-metabolism-sp.html

5.- investigar los Rf reportados en la literatura para los aminoácidos aquí utilizados. Anote el sistema de fase móvil y fase estacionaria utilizado para obtenerlos.

Rf de los aminoácidos de referencia

Aminoácido

Rf


Lisina

0.24

Ácido glutámico

0.47

Glicina

0.49

Cisteina

0.12

Serina

0.31

Metionina

0.59

Fenilalanina

0.66

Arginina

0.28

Valina

0.59

Triptófano

0.60

Histidina

0.29

Treonina

0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=135478

6.- hacer una investigación sobre el uso actual del aspartame. Anote posibles beneficios y perjuicios del uso de este producto.

Comunicado de la FDA sobre el Estudio Europeo de aspartame

CFSAN / Oficina de Seguridad Alimentaría de aditivos

20 de abril 2007
La FDA ha concluido su examen sobre el estudio de carcinogenicidad a largo plazo de aspartame titulado, "a largo plazo de carcinogenicidad bioensayos para evaluar el potencial de los efectos biológicos, en particular cancerígenos, del aspartame administrado en la alimentación de ratas Sprague-Dawley", realizado por el Ramazzini Europea Fundación (ERF), con sede en Bolonia, Italia. La FDA revisó los datos del estudio puestos a su disposición por el ERF y considera que no es compatible con la conclusión de la ERF que el aspartame es un agente carcinógeno. Además, estos datos no proporcionan evidencia para alterar la conclusión de la FDA que el uso del aspartame es seguro.

El aspartame fue aprobado por primera vez en los Estados Unidos en 1981 y es uno de los edulcorantes artificiales más utilizados. Cuando metabolizado por el organismo, el aspartame se descompone en dos aminoácidos comunes, ácido aspártico y fenilalanina, y una tercera sustancia, el metanol. Estas tres sustancias están en cantidades similares o mayores al comer alimentos comunes.

Al primero de aprendizaje de los resultados del estudio ERF, la FDA pidió a los datos de la ERF para evaluar los resultados. El 28 de febrero de 2006, la agencia recibió sólo una parte de los datos del estudio solicitado. En junio de 2006, la FDA pidió ERF para proporcionar el resto de los datos del estudio solicitado inicialmente y también se ofreció a revisar muestras de patología del estudio. ERF no presentó datos adicionales a la FDA y no está de acuerdo a la revisión de la FDA de las muestras de patología.

La FDA no pudo llevar a cabo una revisión completa y definitiva del estudio porque ERF no proporcionó los datos del estudio completo. Con base en los datos disponibles, sin embargo, hemos identificado deficiencias significativas en el diseño, realización, presentación de informes, y la interpretación de este estudio. La FDA considera que la fiabilidad y la interpretación de los resultados del estudio se ve afectada por estas deficiencias y variables no controladas, tales como la presencia de la infección en los animales de experimentación.

Además, los datos que fueron proporcionados a la FDA no parecen apoyar los hallazgos relacionados con el aspartame informado por el ERF. Basado en nuestra revisión, los cambios patológicos fueron incidentales y apareció espontáneamente en el estudio, los animales, y ninguno de los cambios histopatológicos informó parecen estar relacionados con el tratamiento con aspartame. La FDA considera que una visión adicional sobre los resultados del estudio podrían ser proporcionadas por una patología a nivel internacional de trabajo respaldado por el examen conjunto de las muestras de tejido apropiado en el estudio.

Teniendo en cuenta los resultados de la gran cantidad de estudios sobre la seguridad del aspartame, incluyendo cinco con anterioridad a cabo estudios negativos carcinogenicidad crónica, un estudio recientemente la epidemiología grande con asociaciones negativas entre el uso de aspartame y la aparición de tumores, y los resultados negativos de una serie de transgénicos tres ensayos del ratón, la FDA no encuentra ninguna razón para modificar su conclusión anterior de que el aspartame es seguro como edulcorante de uso general en los alimentos.

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