Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas

Represión Catabólica

I. Introducción, reacciones básicas y vectores moleculares

1. 
   Objetivos del análisis de genes.
   
2. 
   Herramientas bioquímicas que se emplean en Biología Molecular.
   

1. 
   Enzimas que actúan sobre ácidos nucléicos. Endonucleasas. DNA polimerasas. DNA ligasa. Fosfatasas y cinasas.
   
2. 
   Construcción de moléculas de DNA recombinantes.
   
3. 
   Vectores moleculares i) derivados de plásmidos, ii) derivados de fagos Lambda.
   

3. 
   Nuevos sistemas de clonación de DNA. Gateway technology, Topo cloning technology.
   

II. Colección y almacenamiento del genoma de un organismo

1. 
   Bibliotecas de DNA recombinante
   

1. 
   Consideraciones generales en la construcción de bibliotecas genómicas y de cDNA. Utilidad de cada tipo de biblioteca
   
2. 
   Sistemas biológicos para la contención de bibliotecas: fagos, bacterias, BACs y YACs. Características, ventajas y desventajas de cada sistema
   
3. 
   Generalidades sobre BACs y YACs.
   

2. 
   Construcción de bibliotecas genómicas
   

1. 
   Extracción y purificación de DNA genómico
   
2. 
   Preparación de los fragmentos a clonar en la biblioteca
   
3. 
   Clonación de las moléculas recombinantes y transformación en bacterias o empaque en cabezas de fagos.
   
4. 
   Diferentes sistemas comerciales para construir bibliotecas genómicas
   

3. 
   Construcción de bibliotecas de cDNA
   

1. 
   Preparación de RNA total y mRNA poli A+
   
2. 
   Estrategias empleadas por los distintos sistemas comerciales (Lambda ZAP (Stratagene), SMART (Clontech), CloneMiner (Invitrogen)) para sintetizar cDNA a partir de RNA mensajero y su clonación en vectores moleculares.
   
3. 
   Ventajas y desventajas de los distintos sistemas
   

III. Aislamiento, identificación y caracterización de genes

1. 
   Aislamiento de genes de una biblioteca
   

1. 
   Escrutinio de bibliotecas de fagos por hibridación con sondas de ácidos nucléicos (Southern blot)
   
2. 
   Preparación de sondas de DNA por marcaje radioactivo y no radioactivo
   
3. 
   Escrutinio de bibliotecas de expresión empleando anticuerpos (técnica de Western blot)
   

2. 
   Reacción en cadena de la polimerasa
   

1. 
   Diseño de primers
   
2. 
   Condiciones para conseguir amplificaciones exitosas
   
3. 
   Diferentes estrategias para clonar genes empleando PCR
   

3. 
   Identificación de la secuencia aislada
   

1. 
   Secuenciación de ácidos nucleicos por el método de Sanger y secuenciación automatizada empleando nucleótidos acoplados a fluoróforos
   
2. 
   Comparación con secuencias reportadas en el GeneBank (Blast Search)
   
3. 
   Demostración de que el gen que aislaste realiza la función propuesta (pruebas de complementación en mutantes)
   

IV. Estudio de la expresión genética.

1. 
   Determinación de la secuencia completa del RNA mensajero
   

1. 
   Primer extension 5' RACE
   
2. 
   Primer extension 3' RACE
   

2. 
   Síntesis/degradación de RNA (introducción)
   

1. 
   Determinación de velocidades de transcripción (run off/run on)
   
2. 
   Degradación de RNA
   

3. 
   Expresión tejido/desarrollo/condición específica
   

1. 
   Diferential Display
   
2. 
   Microarrays
   
3. 
   RT-PCR
   

V. Regulación de la expresión genética

1. 
   Estudio de los factores en cis (secuencias)
   

1. 
   Uso de genes reporteros para medir actividad de promotores
   
2. 
   Introducción de DNA a células eucarióticas: transfección, electroporación, bombardeo, uso de Agrobacterium tumefasciens
   

2. 
   Factores en trans (proteínas)
   

1. 
   Interacciones proteína-DNA. Gel shift.
   
2. 
   Mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción a promotores.
   
3. 
   Interacciones proteína-RNA. Transcripción in vitro. UV. Crosslinking
   

3. 
   Interacciones proteína-proteína. Sistema de doble híbrido
   

VI. Producción de proteínas recombinantes

1. 
   Escherichia coli
   

1. 
   Promotores/sistemas empleados para controlar la inducción de proteína recombinante
   
2. 
   Producción de proteínas de fusión (Maltose binding protein, Gluthathione-S-transferase) c-Myc y con etiquetas de Histidinas (pQE System)
   

2. 
   En sistemas eucariotes
   

1. 
   Baculovirus
   
2. 
   Levaduras (Picchia pastoris)
   

VII. Análisis de la función de productos génicos (proteínas)

1. 
   Mutagénesis dirigida: función de aminoácidos conservados y dominios protéicos
   
2. 
   Gene targeting (knockout)
   
3. 
   Gene silencing (RNA de interferencia)
   
4. 
   Tecnología antisentido en plantas
   

IX. Descubriendo la localización de los productos génicos

1. 
   Hibridación in situ
   
2. 
   Proteína verde fluorescente (GFP): herramienta para la determinación de la localización sub-celular y otros usos
   
3. 
   Empleo de etiquetas para determinar la localización sub-celular
   

X. Análisis de sistemas

1. 
   Genómica
   
2. 
   Metagenómica