Norma oficial Mexicana nom-218-ssa1-2011, Productos y servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba




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B 7.3 Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

B 7.3.1 Fundamento

El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.

B 7.3.2 Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.

B 7.3.2.1 Soluciones diluyentes

Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)

Ingredientes

Cantidades

Fosfato monopotásico

34,0 g

Agua

1,0 l

Preparación

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.

Llevar con agua a un litro.

Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).

Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.

Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.

Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.

Agua peptonada

Ingredientes

Cantidades

Peptona

1,0

NaCl

8,5 g

Agua

1,0 l

Preparación:

Disolver los componentes en un litro de agua.

Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.

Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.

Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.

Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.

Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.

B 7.3.2.2 Medio de cultivo

Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA)

Ingredientes

Cantidades

Peptona

7,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Lactosa

10,0 g

Sales biliares

1,5 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Rojo neutro

0,03 g

Cristal violeta

0,002 g

Agar

15,0 g

Agua

1,0 l

Preparación:

Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.

Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.

Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.

Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.

Evitar el sobrecalentamiento del medio.

No debe esterilizarse en autoclave.

Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.

En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.

B 7.3.3 Materiales

B 7.3.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de algodón.

B 7.3.3.2 Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.

B 7.3.3.3 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.

B 7.3.3.4 Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.

B 7.3.3.5 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.

B 7.3.3.6 Cajas Petri.

B 7.3.3.7 Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:

B 7.3.3.8 Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.

B 7.3.3.9 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.

B 7.3.4 Aparatos e instrumentos

B 7.3.4.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.

B 7.3.4.2 Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.

B 7.3.4.3 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.

B 7.3.4.4 Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).

B 7.3.4.5 Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.

B 7.3.4.6 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0°C, provista con termómetro calibrado.

B 7.3.4.7 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.

B 7.3.4.8 Registrador mecánico o electrónico.

B 7.3.4.9 Microscopio óptico.

B 7.3.4.10 Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.

B 7.3.5 Preparación de la muestra

La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la sección B 7.1 “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.”

B 7.3.6 Procedimiento

B 7.3.6.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.

B 7.3.6.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.

B 7.3.6.3 Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

B 7.3.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

B 7.3.6.5 Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad.

B 7.3.6.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 mL del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.

B 7.3.6.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.

B 7.3.6.8 Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.

B 7.3.6.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

B 7.3.7 Cálculos del método

B 7.3.7.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.

Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios del punto B 7.2.8.1 ”Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.”

B 7.3.7.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características.

Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución correspondiente.

B 7.3.7.3 Placas con colonias no características.

Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.

B 7.3.8 Informe de la prueba

Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por mL".

B 7.4 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.

B 7.4.1 Fundamento

La presente técnica para la detección de Salmonella spp. en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

B 7.4.1.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella spp. dañadas a una condición fisiológica estable.

B 7.4.1.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella spp. e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

B 7.4.1.3 Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella spp. y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.

B 7.4.1.4 Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella spp. y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

B 7.4.1.5 Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.

B 7.4.2 Reactivos

En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.

Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.

B 7.4.2.1 Medios de pre-enriquecimiento

B 7.4.2.1.1 Agua de peptona tamponada

Ingredientes

Cantidades

Peptona

10,0 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Fosfato sódico dibásico

3,5 g

Fosfato potásico monobásico

1,5 g

Agua

1,0 L

Preparación

Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.

Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0.

Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba.

Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC.

B 7.4.2.1.2 Caldo lactosado

Ingredientes

Cantidades

Extracto de carne

3,0 g

Peptona

5,0 g

Lactosa

5,0 g

Agua destilada

1,0 g

pH final 6,9 + 0,2

Preparación

Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65ºC.

Distribuir en porciones de 225 mL, en frascos de 500 mL.

Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.

B 7.4.2.2 Medios de enriquecimiento

B 7.4.2.2.1 Caldo selenito-cistina

Ingredientes

Cantidades

Tristona o polipeptona

5,0 g

Lactosa

4,0 g

Fosfato disódico

10,0 g

Selenito ácido de sodio

4,0 g

L- cistina

0,01 g

Agua destilada

1,0 l

pH final 7,0 + 2 a 25 °C




Preparación

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en recipientes estériles, según se requiera.

El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación.

Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110ºC ± 1ºC, tomando entonces un color salmón.
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