Objetivos
descargar 60.1 Kb.
|
PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNAObjetivos
IntroducciónEl espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Parte de la identificación de una molécula se determina por el trazado del espectro de absorción (A en función de la longitud de onda ) en la región visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación del compuesto mediante una reacción química). Leyes que rigen la espectrofotometríaCuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P0. La relación entre ambos se denomina transmitancia, T: T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación general: -log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2) donde: c es la concentración b es la longitud de la celda o paso óptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que la relación -log P / P0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superíndice así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción (). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice. Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es b. Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción. Determinación de proteínasDos aplicaciones comunes de la determinación de proteínas son: 1) para reportar la actividad específica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogéneo de proteína en geles de poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios métodos para medir proteínas totales, ¿Cómo se escoge entre estos métodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisión es más importante. Cuantificación de proteínas por el método colorimétrico de Lowry. El ensayo de determinación de proteínas por Lowry es uno de los más usados en Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína. Material y equipoCeldas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 L 1 Micropipeta 20-200 L 1 Micropipeta 200-1000 L Vórtex Espectrofotómetro (por grupo) Reactivos
Desarrollo experimental Determinación de proteínas por el método de Lowry.
Tabla 1.1. Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA y la determinación de la concentración de proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry para su determinación.
* La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores. ** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se añadieron del estándar de BSA. Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresión de la curva estándar generada. Cuestionario
Referencias
|
