Secretaria de medio ambiente y recursos naturales




descargar 358.06 Kb.
títuloSecretaria de medio ambiente y recursos naturales
página5/10
fecha de publicación13.01.2016
tamaño358.06 Kb.
tipoCursos
med.se-todo.com > Ley > Cursos
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

4.5 Estufa de esterilización con capacidad para medir temperatura de 170°C ± 10°C.

4.6 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.

4.7 Parrilla con agitación y calentamiento.

4.8 Potenciómetro con intervalo de medición de 6,9°C ± 0,2°C.

4.9 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura entre 2 y 4°C ± 0,2°C.

5. Procedimiento

Los puntos siguientes describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1 Preparación de medios de cultivo y soluciones

5.1.1 Caldo lauril-triptosa con púrpura de bromocresol (C.L.T.).

Fórmula




Triptosa

20,00 g

Lactosa

05,00 g

Fosfato dipotásico (K 2HPO 4)

02,75 g

Fosfato monopotásico(KH2 PO4)

02,75 g

Cloruro de sodio(NaCl)

05,00 g

Lauril sulfato de sodio

00,10 g

Púrpura de bromocresol

00,01 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 35,6 g del medio que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y 0,01 g de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada.

Verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo, durante no más de una semana.

5.1.2 Caldo lactosado con púrpura de bromocresol (C.L.).

Fórmula




Extracto de carne

06,00 g

Peptona

10,00 g

Lactosa

10,00 g

Púrpura de bromocresol

0,01 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 13,0 g del medio C.L. que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y 0,01 g de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir volúmenes de 10 ml del medio en tubos de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de . polvo, durante no más de una semana.

5.1.3 Medio líquido A-1

Fórmula




Lactosa

5,00 g

Triptosa

20,00 g

Cloruro de sodio (NaCl)

5,00 g

Salicina

0,50 g

Eter p-isooctilfenil de polietilenglicol (Tritón X-100 y Haas, o equivalente)

01,00 ml

Agua destilada

1 000,00 ml

Calentar hasta la disolución de los ingredientes sólidos. Añadir el éter p-isooctifenil de polietilenglicol.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,1, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N. Distribuir volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo con campana de Durham, tapar con tapones de aluminio. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 minutos.

Este medio se debe conservar en oscuridad a temperatura ambiente durante no más de 7 días.

5.1.4 Medio EC

Fórmula




Triptosa o tripticasa

20,00 g

Lactosa

05,00 g

Mezcla de sales biliares

1,50 g

Fosfato dipotásico (K2HPO4)

4,00 g

Fosfato monopotásico (KH2 PO4)

1,50 g

Cloruro de sodio (NaCl)

5,00 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 37,0 g del medio EC que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, con la ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Distribuir volúmenes de 10 ml del medio en tubos de ensayo, conteniendo en su interior tubos de Durham invertidos, tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo, durante no más de una semana.

5.1.5 Solución madre de tampón A

Fórmula




Fosfato monopotásico (KH2PO4)

34,00 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solución de hidróxido de sodio 1 N y aforar a 1 L de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y almacenar en refrigeración (entre 2 y 4°C). La solución es estable durante meses. Desechar . cuando se observe turbiedad.

5.1.6 Solución madre de tampón B

Fórmula




Cloruro de magnesio (MgCl2 .6H2O)

8,10 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver el cloruro de sodio de magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada, posteriormente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Almacenar en refrigeración (entre 2 y 4°C). La solución es estable durante meses, desechar cuando haya turbiedad.

Solución tampón de fosfatos (agua de dilución).

5.1.7 Adicionar 1,25 ml de la solución madre de tampón A y 5 ml de la solución madre de tampón B y aforar a 1 L con agua destilada. Distribuir volúmenes de 9,2 ml y 36 ml en tubos de rosca y frascos con tapa de cierre hermético, respectivamente. Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y almacenar a temperatura ambiente.

5.1.8 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N

Fórmula




Hidróxido de sodio (NaOH)

04,00 g

Agua recién destilada

1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 4,0 g de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2 para abatir la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.1.9 Solución de hidróxido de sodio 1 N

Fórmula




Hidróxido de sodio (NaOH)

40,00 g

Agua recién destilada

1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 40 g de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO2 para abatir la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.2 Calibración de aparatos

Todos los equipos utilizados deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante o bien contra equipos certificados.

5.3 Seguridad

Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubrebocas, para evitar cualquier riesgo de infección.

Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y después del ensayo.

5.4 Manejo de residuos

Todos los residuos de la muestra analizada y sobrantes serán esterilizados en autoclave antes de su desecho.

5.5 Preparación de la muestra

a) Suspender X g de materia fresca que correspondan a 4 g de sólidos totales en 36 ml de agua de dilución y así obtener una dilución de 10-1.

b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitación, a velocidad baja (800 rpm), hasta la completa disolución.

5.6 Preparación de diluciones

Por el origen de las muestras se requieren inóculos menores a 1 ml, utilizando diluciones seriadas de submúltiplos de 10.

a) Se preparan diluciones decimales seriadas a partir del homogeneizado resultante (10-1) lo antes posible, reduciendo al mínimo la sedimentación. Transferir 1 ml en 9 ml de agua de dilución (10-2) y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada.

b) Cada dilución debe ser homogeneizada perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos, haciendo un arco con la muñeca de 30 cm de arriba abajo o con un sistema de agitación que proporcione resultados equivalentes. Es importante efectuar la agitación siempre de la misma manera, para obtener resultados comparables.

c) Se debe utilizar una pipeta estéril diferente, para cada una de las diluciones decimales subsecuentes. Para aforar el líquido de la pipeta, deberá aplicarse la punta de ésta en el interior del cuello manteniéndola en posición vertical, inclinando el tubo. Nunca se debe introducir, a la muestra, más de la tercera parte de la pipeta.

d) Si una muestra o un lote de muestras va a ser analizado por primera vez, utilizar al menos cuatro series de tres (o cinco) tubos cada una, posteriormente tres series de tres tubos serán suficientes.

5.7 Determinación de coliformes fecales

5.7.1 Prueba directa (medio A-1)

La prueba directa del medio líquido A-1 es un método de un solo paso que no requiere confirmación. Sin embargo, su uso representa un mayor costo ya que este medio no se encuentra en forma deshidratada, siendo necesario prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

a) Adicionar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubos conteniendo líquido A-1 correctamente etiquetados. Incubar durante 3 horas a 35 ± 0,5° C.

b) Una vez transcurrido el tiempo los tubos se transfieren a un baño de agua a una temperatura de
44,5 ± 0,2°C y se incuban durante otras 21 ± 2 horas.

c) La presencia de gas en cualquier cultivo en medio A-1 a las 24 horas o menos de incubación es una reacción positiva que indica la existencia de coliformes de origen fecal.

5.7.2 Prueba indirecta

5.7.2.1 Prueba presuntiva (caldo lauril-triptosa o caldo lactosado)

a) Transferir 1 ml de las diluciones seleccionadas a cada una de las series de tubos correspondientes conteniendo el caldo lauril o caldo lactosado e incubar a 35 ± 0,5°C.

b) Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. La acidificación, con o sin producción de gas (cambio de coloración de púrpura a amarillo), a partir de la fermentación de la lactosa en el medio de cultivo, indica una prueba presuntiva positiva de la presencia de bacterias del grupo coliformes. En caso contrario reincubar durante otras 24 horas más.

c) La acidificación del medio, con o sin formación de gas dentro de las 48 ± 3 horas, constituye una prueba presuntiva positiva. Cuando no existe acidificación del medio, constituye una prueba.

5.7.2.2 Prueba confirmativa flama del (medio EC)

a) Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran por triple asada (esterilizada al mechero y enfriada) en tubos de fermentación presuntiva negativa que contengan caldo EC e incubados a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua.

b) Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas.

c) El resultado será positivo cuando haya producción de gas a partir de la fermentación de la lactosa contenida en el medio EC. Los tubos sin formación de gas se desechan.

6. Cálculos

6.1. El NMP de coliformes fecales se obtiene a partir del código compuesto por los tubos con resultado positivo en el medio EC o en A-1. Si se inoculan tres series de tres tubos y se utilizan volúmenes decimales diferentes a los indicados en la tabla, se obtiene el código formado por el número de tubos con resultados positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a través de la siguiente fórmula:

NMP=(NMP de tablas) X (10/mayor volumen inoculado) (1)

Por ejemplo: en medio EC se obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,01; 2/3 para la serie de la dilución 0,001 y 1/3 para la serie de la dilución 0,0001.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

similar:

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconSegunda seccion secretaria de medio ambiente y recursos naturales

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconSegunda seccion secretaria de medio ambiente y recursos naturales

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconAl margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos...

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconAl margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos...

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconAl margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos...

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconSecretaria de medio ambiente y recursos naturales norma oficial Mexicana...

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconSecretaria de medio ambiente y recursos naturales norma oficial Mexicana...

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconComite consultivo nacional de normalizacion de medio ambiente y recursos naturales

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconComite consultivo nacional de normalizacion de medio ambiente y recursos naturales

Secretaria de medio ambiente y recursos naturales iconComite consultivo nacional de normalizacion de medio ambiente y recursos naturales


Medicina



Todos los derechos reservados. Copyright © 2015
contactos
med.se-todo.com