Secretaria de medio ambiente y recursos naturales




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6.2 El código es de 3, 2, 1; el índice de coliformes en tabla es de 150, por lo que el resultado es:

NMP/g ST= (150) x (10/0,01) = 150 000 (2)

NMP/g ST=1,5 x 10 5 coliformes fecales (3)

6.3 Cuando se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se utilizan los resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas inoculadas.

6.4 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de las tablas del NMP. Así los códigos como 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junto con muchos otros, no están incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con una frecuencia mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del NMP no aparezca en tablas, se utilizará la siguiente fórmula:

NMP = (Número de tubos positivos x 100)/ Ö [(ml muestra tubos neg.) x (ml muestra total)] (4)

La frecuencia de obtención de resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (< 1%), de otra forma se tendrá que revisar y confirmar el procedimiento de la prueba.

7. Expresión de resultados

7.1. La densidad de los coliformes fecales se expresa como NMP de coliformes por g de materia seca o ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los límites de confianza al 95% para cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubos positivos posibles. Para su utilización se proporcionan códigos formados por tres algoritmos correspondientes al número de tubos con resultados positivos en tres series consecutivas.

7.2. Interferencias

La posible presencia de otras bacterias que producen ácido a partir de lactosa, lo que se elimina en la prueba confirmativa a la temperatura de 44,5°C.

Es importante que los tubos de Durham colocados en los tubos de fermentación, una vez preparados
y esterilizados, no presenten aire en su interior. En caso contrario se pueden obtener resultados
positivos falsos.

8. Informe de prueba

El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos:

a) Todos los datos necesarios para la identificación completa de la muestra;

b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8, y

c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.

ANEXO IV

METODO PARA LA CUANTIFICACION DE Salmonella spp. EN LODOS Y BIOSOLIDOS

El presente método establece la técnica para llevar a cabo la cuantificación de Salmonella spp. mediante la técnica de tubos múltiples o número más probable (NMP) en lodos y biosólidos, con el fin de evaluar su calidad y la eficiencia de los tratamientos de los mismos. Este método es aplicable para la evaluación de
la calidad de los lodos y biosólidos.

1. Principio

Este método de análisis se basa en los siguientes principios:

1.1 A partir de un enriquecimiento con medios selectivos, que contienen sustancias inhibidoras, se favorece la multiplicación de Salmonella spp., reconstituyendo a su vez la vitalidad de las células dañadas y, de igual forma, impidiendo el desarrollo de bacterias coliformes asociadas.

1.2 Una vez realizada la selección, las bacterias presentes en una muestra pueden ser separadas por agitación, dando por resultado una suspensión de células bacterianas, uniformemente distribuidas, a través de diluciones sucesivas de la muestra.

1.3 La aplicación de pruebas bioquímicas que permiten conocer el perfil bioquímico de las cepas en estudio para compararlo, con el que generalmente exhiben las cepas del género Salmonella spp.

2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra

El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad del lodo, por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo a lo referido en el Anexo II de esta Norma.

2.1 La muestra deberá ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y previamente esterilizados.

2.2 Las muestras deben ser colocadas en hieleras con bolsas refrigerantes o hielo inmediatamente después de su toma.

2.3 Los tiempos de conservación en refrigeración y transporte deben reducirse al mínimo.

2.4 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos totales (ST) en por ciento en peso y posteriormente se obtendrá el peso en fresco que corresponda a 4 g de ST.

2.5 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeración y no transcurrir más de 48 horas.

3. Reactivos y materiales

. 3.1 Reactivos

3.1.1 Agar Hierro Lisina (LIA).

3.1.2 Agar Sulfito de Bismuto.

3.1.3 Agar Triple Azúcar Hierro (TSI).

3.1.4 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD).

3.1.5 Alcohol etílico.

3.1.6 Caldo de Selenito Cistina.

3.1.7 Caldo de Tetrationato.

3.1.8 Cloruro de magnesio.

3.1.9 Cristales de yodo.

3.1.10 Fosfato monopotásico.

3.1.11 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

3.1.12 Solución de hidróxido de sodio 1 N.

3.1.13 Solución tampón de fosfatos (agua de dilución).

3.1.14 Verde brillante.

3.1.15 Yoduro de potasio

3.2 Materiales

3.2.1 Barras magnéticas.

3.2.2 Bulbo de goma.

3.2.3 Cajas Petri estériles (100 x 15 mm.).

3.2.4 Espátula.

3.2.5 Frascos de 100 ml de capacidad con tapa de cierre hermético y capacidad de esterilizado en autoclave.

3.2.6 Frascos de 1 L de capacidad con tapa de cierre hermética.

3.2.7 Gradillas y canastillas de acero inoxidable, matraces Erlenmeyer de vidrio, de 1 y 2 L de capacidad.

3.2.8 Guantes de látex.

3.2.9 Matraz aforado de 1 L.

3.2.10 Mechero de Bunsen, lámpara de alcohol o similar.

3.2.11 Pipetas graduadas de vidrio de 1, 5 y 10 ml.

3.2.12 Portapipeteros de acero inoxidable.

3.2.13 Tapabocas.

3.2.14 Tapones de acero inoxidable para tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o
12 mm x 120 mm).

3.2.15 Tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o de 12 mm x 120 mm).

3.2.16 Tubos de rosca (13 mm x 100 mm).

4. Aparatos e instrumentos

4.1 Autoclave a una presión de 1,05 kg/cm2, y una temperatura de 121°C.

4.2 Balanza analítica con intervalo de medición de 0,000 1 a 10,00 g.

4.3 Balanza granataria con intervalo de medición de 0,1 a 100 g.

4.4 Baño de agua (con agitación) con capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C.

4.5 Estufa u horno con capacidad para operar a una temperatura de 180°C ± 10°C.

4.6 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.

4.7 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 41°C ± 0,2°C.

4.8 Parrilla con agitación y calentamiento.

4.9 Potenciómetro con intervalo de medición de 6,5 a 7,5 ± 0,2 pH.

4.10 Refrigerador con capacidad para operar entre 2 y 4°C ± 0,5°C.

5. Procedimiento

Los siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1 Preparación de medios de cultivo y soluciones

5.1.1 Caldo tetrationato

Fórmula




Proteosa peptona o triptona

05,00 g

Sales biliares

01,00 g

Carbonato de calcio

10,00 g

Tiosulfato de sodio

30,00 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 16 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en agua destilada y calentar hasta ebullición, posteriormente distribuir en volúmenes de 100 ml en recipientes estériles y conservar entre 5 y 8°C. Antes de usar el medio, agregar 2 ml de solución de yodo yoduro y 1 ml de solución de verde brillante 1:1 000 por cada 100 ml de caldo, a cada recipiente.

Una vez que la solución de yodo yoduro ha sido adicionada al medio, éste deberá ser utilizado de forma inmediata. Nunca se debe volver a calentar.

5.1.2 Caldo selenito cistina

Fórmula




Triptona o polipeptona

05,00 g

Lactosa

04,00 g

Fosfato disódico

10,00 g

Selenito ácido de sodio

04,00 g

L- Cistina

00,01 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Preparación:

Disolver los ingredientes o 23 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en agua destilada. Calentar hasta ebullición durante 10 minutos en un baño de agua y distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo, para esterilizar 10 minutos por arrastre de vapor. Verificar que el pH sea de
7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

El medio se debe utilizar el mismo día de su preparación.

5.1.3 Agar sulfito de bismuto

Fórmula




. Extracto de carne de res

05,00 g

Peptona

10,00 g

Glucosa

05,00 g

Fosfato disódico (anhidro)

04,00 g

Sulfato ferroso (anhidro)

00,30 g

Sulfito de bismuto

08,00 g

Verde brillante

00,025 g

Agar

20,00 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Suspender los ingredientes o 52 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado,
en 1 L de agua destilada, calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente.

Verificar que el pH sea de 7,6 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a 60°C y distribuir en cajas de Petri estériles.

El medio no debe esterilizarse en autoclave, el sobrecalentamiento afecta su selectividad.

5.1.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Fórmula




Xilosa

03,75 g

L Lisina

05,00 g

Lactosa

07,50 g

Sacarosa

07,50 g

Cloruro de sodio

05,00 g

Extracto de levadura

03,00 g

Rojo de fenol

00,08 g

Agar

15,00 g

Tiosulfato de sodio

06,80 g

Desoxicolato de sodio

02,50 g

Citrato de hierro y amonio

00,80 g

Agua destilada

1 000,00 ml

Suspender los ingredientes o 52 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado,
en 1L de agua destilada. Agitar frecuentemente y dejar que hierva durante 1 minuto, evitar un sobrecalentamiento, si bien, su reacción puede ser satisfactoria, las colonias tienden a ser muy pequeñas. El medio nunca se debe esterilizar en autoclave.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a no menos de 50°C pero abajo de 60°C y vaciar en cajas Petri estériles.

5.1.5 Agar verde brillante (VB)

Fórmula




Extracto de levadura

03,00 g

Proteosa peptona número 3 polipeptona

10,00 g

Cloruro de sodio

05,00 g

Lactosa

10,00 g

Sacarosa

10,00 g

Rojo de fenol

00,08 g

Verde brillante

00,012 5 g

Agar

20,00 g

Preparación

Suspender los ingredientes o lo indicado por el medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en 1 L de agua destilada, mezclar bien y calentar hasta ebullición. Verificar que el pH sea de
6,9 ± 0,1 en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Esterilizar en autoclave a 121°C por 12 minutos, cualquier sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en cajas de Petri estériles.
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