Secretaria de medio ambiente y recursos naturales




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i) Existen pruebas alternas cualitativas, aunque de mayor costo, que pueden ser empleadas como es el caso de la prueba miniaturizada API-20E y la confirmación serológica que permiten identificar la especie
y el serotipo, respectivamente.

j) Si el laboratorio lo prefiere es factible utilizar el caldo de selenito cistina como medio de enriquecimiento y el caldo de tetrationato como medio selectivo.

6. Cálculos

6.1 El NMP de Salmonella spp. se obtiene a partir del código compuesto por los tubos con resultado positivo en el caldo de selenito cistina. Si se inoculan tres series de tres tubos y se utilizan volúmenes decimales diferentes a los indicados en tablas, se obtienen el código formado por el número de tubos con resultados positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a través de la siguiente fórmula:

NMP = (NMP de tablas) x (10/mayor volumen inoculado) (1)

Por ejemplo: en medio selenito cistina se obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,1; 2/3 para la serie de la dilución 0,01 y 1/3 para la serie de la dilución 0,001.

El código es de 3, 2, 1 al consultar en las tablas obtenemos un valor de 150, el resultado es:

NMP/g ST= (150) x (10/0,1) = 15 000 (2)

NMP/g ST= 1,5 x 10 4 Salmonella (3)

6.2 Cuando se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se utilizan los resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas inoculadas.

6.3 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de las tablas del NMP. Así los códigos como 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junto con muchos otros, no están incluidos. Ello se debe a que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables aparecen con una frecuencia mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del NMP no aparezca en tablas, se utilizará la siguiente fórmula:

NMP = (Número de tubos positivos x 100)/ Ö [(ml muestra tubos neg.) x (ml muestra total)] (4)

. La frecuencia de obtención de resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (menor 1%), de otra forma se tendrá que revisar y confirmar.

7. Expresión de resultados

7.1 La densidad de Salmonella spp. se expresa como NMP de coliformes por g de materia seca o ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los límites de confianza al 95% para cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubos positivos posibles.

7.2 Para su utilización se proporcionan códigos formados por tres algoritmos correspondientes al número de tubos con resultados positivos en tres series consecutivas.

8. Informe de prueba

El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos:

a) Todos los datos necesarios para la identificación completa de la muestra.

b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8.

c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier operación no especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.

ANEXO V

METODO PARA LA CUANTIFICACION DE HUEVOS DE HELMINTOS EN LODOS Y BIOSOLIDOS

El presente método tiene por objeto establecer la técnica para la detección, enumeración, determinación y de la viabilidad, en caso requerido, de huevos de helmintos en muestras de lodos y biosólidos, con el fin de evaluar la calidad de estos subproductos y la eficiencia de los sistemas de tratamiento a los que están sujetos.

1. Principio

La prueba se basa en el siguiente principio:

1.1 Por medio de lavados continuos, combinados con diversas etapas de filtración y flotación se logra la separación de los huevos de helmintos del resto de las partículas de mayor y menor tamaño, así como su concentración.

1.2 Permite, en caso de ser requerido, determinar la viabilidad de los huevos de helminto y con ello confirmar la calidad de diversos procesos de estabilización en lodos.

2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra

El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad del lodo, por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo con lo referido en el punto 5 de esta Norma.

2.1 Preparar recipientes de plástico inerte de 500 ml de boca ancha y de cierre hermético, previamente desinfectados con cloro comercial, lavados con agua potable a chorro y enjuagados con agua destilada.

2.2 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos totales (ST) en por ciento en peso para, posteriormente, tomar en los recipientes el peso en fresco (X) que corresponda a 2 g de ST, para todo tipo de lodos.

2.3 Mantener la muestra a una temperatura de 4°C ± 2°C hasta su llegada al laboratorio.

2.4 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeración hasta
su análisis.

3. Reactivos y materiales

3.1 Reactivos

3.1.1 Acetato de etilo (C2H5 .OCOOCH3) (opcional).

3.1.2 Acetato de sodio trihidratado (CH3 COONa. 3H2O) (opcional).

3.1.3 Acido acético (CH3 COOH) (opcional).

3.1.4 Acido sulfúrico 0,1 N (H2SO4).

3.1.5 Alcohol etílico (C2 H5 OH).

3.1.6 Agua destilada.

3.1.7 Eter etílico.

3.1.8 Hipoclorito de sodio10% (NaClO).

3.1.9 Formaldehído 37% (opcional).

3.1.10 Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 .7H2 O).

3.1.11 Tween 80 al 0,1%.

3.2 Materiales

3.2.1 Barras magnéticas.

3.2.2 Bulbo de goma.

3.2.3 Embudo de plástico con diámetro de 20 cm.

3.2.4 Espátula.

3.2.5 Gradillas para tubos de centrífuga 50 ml.

3.2.6 Guantes de látex.

3.2.7 Manguera para conexión de matraz.

3.2.8 Matraces aforados Erlenmeyer de 1 L de capacidad.

3.2.9 Matraz Kitazato de 4 L.

3.2.10 Pipetas de 10 ml de plástico.

3.2.11 Pizeta de plástico de 1 L.

3.2.12 Probetas graduadas de 10 ml, 50 ml y de 1 L.

3.2.13 Recipientes de cierre hermético de 1 a 3 L de capacidad.

3.2.14 Recipientes de plástico inerte con paredes internas lisas de 3 L de capacidad.

3.2.15 Recipientes de plástico inerte, boca ancha, de 500 ml de capacidad y susceptibles de ser esterilizados en autoclave.

3.2.16 Tamiz de 20 mm (milimicras) de poro (opcional).

3.2.17 Tamiz de 150 a 170 mm (milimicras) de poro.

3.2.18 Tapabocas.

3.2.19 Tubos de centrífuga cónicos, de plástico 50 y 200 ml (o de mayor capacidad).

4. Aparatos y/o instrumentos

4.1 Agitador de tubos con control de velocidad y adaptable a tubos de diferentes tamaños.

4.2 Autoclave capaz de operar a una presión de 1,05 kg/cm2 y una temperatura de 121°C.

4.3 Balanza granataria con intervalo de medición de 2,0 a 800 g ± 0,2 g.

4.4 Bomba de vacío con control de velocidad de succión.

4.5 Cámara de Sedgwich-Rafter o disco Doncaster.

4.6 Campana de extracción.

4.7 Centrífuga, capaz de mantener los intervalos de operación de 660 ± 300 g.

4.8 Densímetro (hidrómetro), con intervalo de medición de 1,0 a 1,4 g/cm 3.

4.9 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 26°C ± 0,2°C.

4.10 Licuadora con contenedor de plástico inerte, paredes lisas y con capacidad de 2 L.

4.11 Mascarilla antigás con carbón activado o similar.

4.12 Microscopio óptico equipado para hacer iluminación (Köhler), campo claro, con objetivos de 10
a 100 X, y platina móvil removible.

4.13 Parrilla con agitación magnética.

4.14 Potenciómetro con intervalo de medición de 0 a 14 ± 0,2 unidades de precisión.

4.15 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura de 4°C ± 0,2°C.

5. Procedimiento

5.1 Preparación de soluciones

Los siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1.1 Solución ácido alcohol, homogeneizar 650 ml de ácido sulfúrico 0,1 N con 350 ml de alcohol etílico. Almacenar la solución en un recipiente hermético.

5.1.2 Solución de formalina al 0,5%, añadir 5 ml de formaldehído al 37% y aforar a 1 000 ml con agua destilada. Homogeneizar y almacenar en recipiente hermético.

5.1.3 Solución patrón de aceto-acético, agregar 15 g de acetato de sodio trihidratado, 3,6 ml de ácido acético y aforar a 1 000 ml de agua destilada. Homogeneizar y almacenar en frasco hermético durante
2 a 3 meses.

5.1.4 Solución de sulfato de zinc (ZnSO4) con gravedad específica de 1,3. Disolver 800 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O) en 1 000 ml de agua destilada, mezclar en la parrilla magnética hasta homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro y, según sea el caso, ajustar la densidad a 1,3 agregando sulfato de zinc o agua destilada, según se requiera. Almacenar en recipiente hermético y verificar densidad cada mes.

5.1.5 Tween 80 al 0,1%, añadir 1 ml del reactivo en 999 ml de agua destilada y homogeneizar en parrilla de agitación hasta su completa disolución. Almacenar en recipiente hermético durante 2 a 3 meses.

5.2 Calibración de aparatos

Todos los equipos deben ser calibrados o ajustados de acuerdo con las especificaciones del fabricante,
o bien, contra equipos certificados.

5.3 Seguridad

5.3.1 Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubreboca, para evitar cualquier riesgo de infección.

5.3.2 Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y después del ensayo.

5.3.3 La agitación de las soluciones con éter deberá realizarse en sitios ventilados o dentro de una campana de extracción, considerando su inflamabilidad. Evitar la inhalación, el contacto con los ojos, piel o ropa, ya que es un reactivo sumamente tóxico.

5.4 Manejo de residuos

5.4.1 Todos los residuos de la muestra analizada serán esterilizados en autoclave antes de su desecho.

5.4.2 Aquel material que sea reutilizado, pero que no pueda ser esterilizado en autoclave deberá ser colocado en hipoclorito de sodio (10%), durante un día, antes de ser lavado.

5.5 Concentración y separación de los huevos de helminto. La recuperación de los huevos de helminto de la muestra se realizará efectuando los siguientes pasos:

a) Por 1 minuto y con la ayuda de una licuadora homogeneizar el peso en freso que corresponda a 2 g de ST. Utilizar para ello 200 ml de una solución de Tween 80 al 0,1%, integrando los enjuagues del recipiente que originalmente contenía la muestra.

b) Recuperar homogeneizado y enjuagues del vaso de la licuadora en un recipiente de plástico de 2 L, utilizar para ello 800 ml de la solución de Tween 80 al 0,1%.

c) Dejar sedimentar la muestra al menos durante 3 horas.

d) Aspirar el sobrenadante por vacío y filtrar el sedimento a través del tamiz de poro seleccionado (150 a 170 mm). Enjuagar recipiente y tamiz con 1 L de agua destilada, para lo cual se recomienda utilizar una pizeta. El filtrado y los enjuagues se recuperan en el recipiente de plástico de 2 L.

e) Dejar sedimentar al menos durante 3 horas.

f) Aspirar el sobrenadante por vacío y recuperar sedimento y enjuagues, con agua destilada, en un tubo de centrífuga de 200 ml o mayor capacidad.

g) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

h) Aspirar el sobrenadante por vacío y desecharlo. Resuspender la pastilla en 150 ml de la solución de sulfato de zinc. Homogeneizar la pastilla con ayuda de un agitador de tubos y, sólo en caso de ser necesario, utilizar aplicadores de plástico o espátula de teflón para lograr su completa disolución.

i) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

j) En caso de contar con un tamiz de 20 mm de poro se recomienda efectuar un segundo filtrado, cuya finalidad es remover el detritus de menor tamaño y facilitar la lectura de los huevos de helminto en el sedimento final al microscopio. Para ello, filtrar el sobrenadante y recuperar la película que ha quedado retenida sobre la malla con el volumen de agua destilada que sea necesario (utilizar pizeta), en un tubo de 200 ml de centrífuga, desechar filtrado y pasar al inciso i. En caso contrario verter el sobrenadante en un recipiente de 2 L y romper la densidad con 1 L de agua destilada.

k) Sedimentar al menos durante 3 horas.

l) Una vez transcurrido el tiempo de sedimentación aspirar el sobrenadante por vacío y recuperar el sedimento resultante en un tubo de centrífuga de 200 ml o mayor capacidad, incluir los enjuagues
del recipiente.

m) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

n) Aspirar el sobrenadante por vacío y resuspender el sedimento por agitación, con ayuda de un agitador de tubos (si es necesario, utilizar aplicadores). La solución resultante se recupera en un tubo cónico de centrífuga de 50 ml, incluyendo el agua destilada de enjuague.

o) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

p) Aspirar el sobrenadante y con ayuda de un agitador de tubos resuspender la pastilla en 15 ml de la solución de alcohol-ácido (u opcionalmente, el patrón de aceto-acético) y, posteriormente, agregar 10 ml de éter (o acetato de etilo, que es menos tóxico). Agitar suavemente y, de vez en cuando, destapar para dejar escapar el gas que se desprenda. Por seguridad, realizar todo este proceso dentro de la campana de . extracción (en el laboratorio) o con mascarilla de protección antigás (en campo).

q) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

r) Aspirar el sobrenadante, hasta 2 mm por arriba de la parte cónica del tubo de 50 ml (aproximadamente 5 ml). Realizarlo bajo las mismas condiciones de seguridad (en el laboratorio) dentro de la campana de extracción o (en campo) con mascarilla de protección antigás.

s) Efectuar un primer enjuague agregando H2SO4 0,1 N (o formalina 0,5%).

t) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

u) Aspirar el sobrenadante, dejando 5 ml y realizar un segundo enjuague agregando H2SO4 0,1 N
(o formalina 0,5%).

v) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

w) Aspirar el sobrenadante dejando 5 ml del mismo.

5.6 Determinación de viabilidad y lectura al microscopio

a) Si no es necesario determinar la viabilidad, proceder a la cuantificación, en caso contrario, incubar el tubo con la muestra durante 4 semanas a 26°C ± 0,2°C. Dejar la tapa del tubo floja para que entre aire y, por lo menos una vez por semana, verificar que el nivel del líquido no disminuya. Si es necesario, agregar
agua destilada.
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