Tesis Doctoral




descargar 135.44 Kb.
títuloTesis Doctoral
página1/6
fecha de publicación03.03.2016
tamaño135.44 Kb.
tipoTesis
med.se-todo.com > Ley > Tesis
  1   2   3   4   5   6

Tesis Doctoral [Escribir texto] [Escribir texto]

iNDICE

  1. Introduccion 5

  2. Materiales y métodos 10

    1. Descripcion general del setup de patch clamp.

    2. Sistema de delivery de soluciones.

    3. Sistema de adquisición de datos.

    4. Software JERO.avi.

    5. Procesamiento de datos.

  3. Desarrollo de método de control de válvulas” 20

    1. Introducción.

    2. The plunger signal method.

  4. Pulsos ultra-cortos. Investigacion de variables y construcción del método” 30

    1. Introduccion

    2. Investigando los frentes de las soluciones.

    3. Solucion a la contaminación de la interface.

    4. El algoritmo.

    5. Buscando pulsos ultracortos.

  5. Barrido de frecuencias” 40

    1. Introducción.

    2. Construyendo el una función de transferencia para

cada frecuencia.

    1. Calculo del voltaje comando.

    2. Pulsos de distinta frecuencia.

    3. Creando pulsos aleatorios.

  1. Conclusión. 50

  2. Referencias. 60

*Contexto histórico. A fines del siglo XIX,  mas precisamente en 1879 Ludimar Hermann publicó varias hipótesis acerca de la localización de las fuerzas electromotrices en un nervio lesionado y las dos más probables fueron, por un lado la “teoría de la alteración”, que hacía referencia a la formación de una fuerza electromotriz entre los segmentos lesionados y sanos de la fibra y por otro lado, la existencia de una fuerza electromotriz en la superficie de las fibras sanas, que fue llamada 'teoría de la pre-existencia.' El principal defensor de la “teoría de la pre-existencia” fue J. Bernstein, quien elaboró una hipótesis sobre el papel de la membrana en la generación del impulso nervioso, que descansaba en tres puntos principales:


  1. todas las células vivas tienen un interior electrolítico rodeado por una membrana permeable a algunos iones;

  2. a través de la membrana en reposo existe una diferencia de potencial, y;

  3. durante la actividad la permeabilidad iónica de la membrana disminuye, de manera que la diferencia de potencial se reduce a un valor relativamente bajo.

 Inicialmente Bernstein desarrolló el primero de esos tres puntos. En un trabajo publicado en 1868 propuso que una célula viva está rodeada por una membrana que es ligeramente permeable a los iones y que el interior está lleno de electrolitos donde los iones se mueven libremente, en forma parecida a como lo hacen en el exterior. Posteriormente analizó el segundo punto tomando como base el trabajo de Walter Hermann Nernst (1864-1941) y en 1902 propuso que las membranas del nervio y del músculo se encuentran polarizadas debido a su permeabilidad selectiva al potasio, que se sabía existía en altas concentraciones dentro de la célula. Por lo tanto, si la membrana que rodea las células era permeable a ese catión pero no a los aniones intracelulares, la difusión del potasio debido a su gradiente de concentración tendería a separar las cargas en la membrana y crearía una doble capa, como había sugerido Nernst. De esta forma quedaría explicado el potencial de reposo.
En relación a ese punto, Bernstein pensaba que la excitación era debida a una pérdida transitoria de la permeabilidad selectiva al potasio, lo que anularía temporalmente el potencial de reposo, dando origen a una perturbación propagada o impulso; cuando el exceso de cargas negativas dentro de la célula se uniera a las cargas positivas de afuera, el potencial de difusión tendería a desaparecer. Cuando las investigaciones en electrofisiología fueron enormemente estimuladas por el uso del electrómetro capilar y del galvanómetro de espejo, Bernstein encontró mas apoyo para su teoría, elaborándola con más detalle en su monografía "Elektrobiologie" (1912).
     La especulación básica de Bernstein era que las células vivas estaban rodeadas de una membrana que tenía una permeabilidad baja para los iones. Por lo tanto, si se hacía pasar una corriente constante a través de una cámara que contuviera células, la mayor parte de la corriente fluiría alrededor de ellas sin penetrarlas.
     Si la membrana era una estructura aislante debería comportarse como un capacitor; esto es, además de su conductancia también tendrá una impedancia. Dado un voltaje aplicado, la cantidad de corriente que cruza la membrana dependerá de su frecuencia, de tal manera que cuando fuera cero (d.c.) fluirá solamente a través de la resistencia; sin embargo, las corrientes alternas serían capaces de cruzar tanto a través del resistor como del capacitor de la membrana. Por lo tanto, midiendo la impedancia de la membrana a diferentes frecuencias sería posible distinguir las contribuciones relativas de la conductancia y de la capacitancia. Entre 1910 y 1913 R. Höber publico los resultados de la medida de la impedancia de una masa de eritrocitos. Höber encontró que la impedancia era de 1,200 Ohmios a 1 KHz, mientras a 10 MHz éste valor decrecía a 200 Ohmios. Esto significaba que la resistencia de la suspensión de células estaba localizada en la membrana superficial y no en el interior de las células, por lo tanto la membrana de los eritrocitos era un mal conductor, mientras el interior tenía una conductancia del orden de cualquier electrolito biológico. Esto confirmaba la hipótesis de Bernstein.
     Con esto se hizo obvio para los fisiólogos de los primeros años del siglo XX que los iones generan fuerzas electromotrices solamente si se restringe la difusión de una de las especies.
W. Nernst, a partir de principios físico-quimicos definió una ecuación que fue utilizada como base para la teoría moderna del potencial de la membrana. Esta ecuación define, en términos de las concentraciones de un ion específico a cada lado de la membrana, el potencial al cual no habrá movimiento neto de este ion para ningún lado. En otras palabras, define el potencial requerido para oponerse exactamente al movimiento de un ion particular a favor de su gradiente de concentración o potencial de equilibrio. Así, si la membrana fuera exclusivamente permeable a un ion específico, entonces el potencial de la membrana sería dado por el potencial de equilibrio a ese ion.
     Para cualquier ión la ecuación es,





http://www.facmed.unam.mx/historia/fotos/nernst.gif


En esta fórmula,

  • Eion, potencial de equilibrio para el ión

  • R, constante universal de los gases

  • T, temperatura absoluta

  • F, constante de Faraday

  • z, valencia del ion (sodio, potasio o cloro)

  • ln, logaritmo natural

  • [ION]i, concentración del ion en el interior de la célula

  • [ION]o, concentración del ion en el exterior de la célula

     Usando las concentraciones de sodio y potasio medidas en la sangre y axoplasma del calamar, la ecuación de Nernst proporciona valores de -75 mV para el potencial de equilibrio del K+ y +55 mV para el del Na+. Con estos valores Hodgkin y Katz (1949) propusieron que en reposo la membrana es predominantemente permeable al potasio y por lo tanto el potencial de reposo es cercano al potencial de equilibrio del potasio, pero durante el potencial de acción se hace predominantemente permeable al Na+ y por lo tanto el potencial se mueve hacia el potencial de equilibrio del Na+. En algunos casos, hacia el final del aumento en la permeabilidad al Na+ hay un gran aumento en la permeabilidad al K+, lo que devuelve al potencial un valor cercano al de equilibrio de K+.
     La hipótesis de Bernstein predecía un aumento inespecífico de la conductancia de la membrana durante el potencial de acción, con lo que el potencial transmembrana llegaría a cero milivoltios. Sin embargo, las mediciones intracelulares hechas por Hodgkin y Huxley (1939), así como las de Curtis y Cole (1942) en axones gigantes del calamar, mostraron claramente que esa predicción no se cumplía, ya que la amplitud máxima del potencial de acción no era igual al potencial de reposo, sino mucho más grande. El significado de ese 'overshoot' fue aclarado por Hodgkin y Katz (1949), quienes propusieron la 'hipótesis del sodio,' sugiriendo que la despolarización y el 'overshoot' del potencial de acción eran debidos a un gran aumento en la conductancia de la membrana al sodio y un consecuente movimiento de este ión hacia el interior de la célula.
     El descubrimiento del sobretiro del potencial de acción, esto es, el hecho de que la polaridad de la membrana se invirtiera (positivo en el interior) durante el valor máximo del potencial de acción, estaba más allá de los fenómenos que podían ser explicados con el concepto de permeabilidad selectiva a los iones potasio que había postulado Bernstein. De hecho, una pérdida transitoria de la permeabilidad al potasio llevaría simplemente a la despolarización de la membrana.
     Es curioso que en el mismo volumen de Pflügers Archiv de 1902 en el que apareció el trabajo de Bernstein, también fueron publicadas las bases para la explicación de esas nuevas observaciones. En esta revista se encuentra un trabajo de Overton, en el que se demuestra que la excitabilidad del músculo de rana se pierde si el cloruro de sodio extracelular se reduce a menos del 10% de la concentración normal. Además, la excitación del músculo se acompaña de una pérdida del potasio intracelular y de una ganancia en el sodio intracelular.
     Poco después que terminó la Segunda Guerra Mundial, Hodgkin continuó la colaboración que había iniciado con Huxley en 1939. Ellos consideraron el flujo de iones a través de la membrana del nervio durante el potencial de acción en forma cuantitativa y rápidamente llegaron a la conclusión de que para explicar el sobretiro era necesario postular que durante el potencial de acción existía una entrada de iones sodio a la fibra. Así, Hodgkin y Katz decidieron investigar el efecto de la concentración externa de sodio sobre el potencial de acción registrado intracelularmente en axones de la pata el cangrejo y en poco tiempo obtuvieron la mayor parte de los resultados experimentales contenidos en un trabajo publicado en 1949.
     Hodgkin colaboró con Huxley para desarrollar una hipótesis que explicaba los efectos del sodio sobre el potencial de acción. Comparando la composición iónica del axoplasma con la del agua de mar se demostraba que la concentración interna de K es aproximadamente 40 veces mayor, mientras la del cloro y del sodio eran aproximadamente 1/10 de las del agua de mar. Por lo tanto, la enorme inversión en el potencial de membrana que ocurre durante el potencial de acción podía ser explicada suponiendo que la membrana del axón no pierde su permeabilidad selectiva al potasio, sino que se vuelve específica para el sodio. Si la concentración interna de sodio era 1/10 de la concentración externa, esto llevaría a una inversión de aproximadamente 60 mV.
     Las dos consecuencias principales de esa hipótesis eran: 1) la amplitud del potencial de acción debería depender de la concentración externa de sodio, y; 2) la magnitud de la inversión del potencial de acción, el 'overshoot' (sobretiro), debía aumentar si la concentración externa de sodio aumentaba. Hodgkin y Katz pudieron confirmar experimentalmente ambas predicciones demostrando que: a) el potencial de acción desaparecía cuando la fibra se encontraba en una solución sin sodio, pero recuperaba su valor inicial cuando se restituía el agua de mar, y; b) la dilución del agua de mar con dextrosa isotónica producía una ligera disminución del potencial de reposo y, además, había una disminución importante y reversible de la magnitud del potencial de acción.
     Todas esas observaciones eran consistentes con la hipótesis y confirmaban tanto el trabajo de Overton (1902) como los hallazgos de Katz (1947), quien había mostrado que las fibras nerviosas de Carcinus  se bloqueban si el cloruro de sodio en el medio externo disminuía a menos del 10-15% del normal.
     Basados en esos resultados, Hodgkin y Huxley desarrollaron un modelo en el que un portador negativamente cargado se combinaría con los iones y los transportaría a través de la membrana. En reposo el portador estaría unido por su negatividad a la superficie externa de la membrana y cuando el potencial de la membrana disminuyera por cualquier razón, el portador quedaría libre para moverse y transportar el sodio. Sin embargo, este mecanismo tuvo que ser revisado y cambiado cuando se obtuvieron los resultados de la aplicación del control de voltaje al axón gigante del calamar.

1.1.12. La hipótesis del sodio (Hodgkin, Huxley y Katz


     En julio de 1939 Hodgkin y Huxley viajaron a Plymouth, donde empezaron a estudiar la viscosidad del axoplasma en axones gigantes de calamar en posición vertical, midiendo que tan rápido caían pequeñas gotas de mercurio. Encontraron que en axones en buenas condiciones las gotas de mercurio no caían o lo hacía muy lentamente, por lo que dedujeron que el axoplasma era casi sólido; sin embargo, en la proximidad de la región cortada del axón o donde éste había sido dañado, las gotas caían rápidamente, sugiriendo que en esas zonas el axoplasma se liquificaba. Estos resultadods sugirieron la posibilidad de introducir un electrodo axial y cuando esto fue hecho, registraron un potencial de reposo de 50 mV negativo en el interior, mientras el potencial de acción era de 100 mV en amplitud. Animados con esos resultados empezaron a probar el efecto de iones potasio, pero la II Guerra Mundial los hizo detener el trabajo y sólo tuvieron oportunidad de publicar una nota en Nature (1939).
     Para 1944 la posición de Inglaterra en la guerra había mejorado sustancialmente y eso, más la lectura de los trabajos que Curtis y Cole (1940, 1942) publicaron en esa época, los animaron a terminar el trabajo sobre los potenciales de reposo y de acción que habían empezado en 1939 (Hodgkin y Huxley, 1945). Es interesante notar que en ese tiempo la hipótesis del sodio para explicar el potencial de acción se había debilitado enormemente, debido en parte a un trabajo, que posteriormente se demostró equivocado, en el que se decía que el potencial de acción del axón gigante de Loligo pealii  podía exceder los 110 mV (Curtis y Cole, 1942). En ese mismo trabajo también se dice que ni el potencial de reposo ni el de acción se afectan cuando todos los iones del espacio extracelular se sustituyen con dextrosa isosmótica y había tenido un gran impacto porque era congruente con las observaciones de que el nervio ciático de rana sobrevivía bien y por muchas horas en soluciones isotónicas de sacarosa, sin iones, un resultado que ahora se atribuye a la impermeabiidad del perineuro.
     Fue quizá el contacto con los nuevos científicos que se incorporaron a Cambridge después de la Guerra (Richard Keynes, David Hill y Peter Lewis), todos ellos con extensos conocimientos químicos, que influyó sobre Hodgkin y Huxley para hacerlos diseñar un sistema químico como base para explicar el potencial de acción. Así, su hipótesis inicial fue que los iones sodio eran transportados a través de la membrana por un portador cargado negativamente, fijo en el estado de reposo debido a cargas electrostáticas, pero que se movería debido a la depolarización pasiva, un efecto que aumentaría y se haría asimétrico por la combinación con iones de calcio externo. En 1947 Huxley incluso calculó el potencial de acción resultante de esas características y en él incluyó un aumento rápido de la permeabilidad al sodio y uno lento para la del potasio.
     Resultados obtenidos por Katz (1947) y por Hodgkin mismo (Webb y Young, 1940) les hicieron pensar que aquellos de Cole sobre la inexcitabilidad del axón gigante en soluciones sin sodio externo estaban equivocados y en enero de 1947 decidieron estudiar el problema más cuidadosamente. Sus resultados mostraron que bajando la concentración de sodio externo en axones aislados de cangrejo se reducía la amplitud del potencial de acción por una cantidad semejante a la calculada con la ecuación de Nernst; esto es, bajando la concentración de sodio por 1/5 el potencial de acción se reducía de 120 a 72 mV (40%). Con estos resultados Hodgkin y Huxley confirmaron la teoría del sodio del potencial de acción.
     Para 1947 Cole y Marmont habían tenido éxito en implementar el control de voltaje del axón gigante del calamar, lo que comunicaron a Hodgkin por carta. Así, cuando en julio de 1948 Hodgkin y Huxley fallaron en sus primeros intentos para perfundir axones gigantes de calamar, decidieron en cambio hacer otros experimentos, en los que usarían la técnica de control de voltaje para probar su hipótesis del portador de sodio. Para esto diseñaron un electrodo con dos alambres de plata, uno para el voltaje y otro para la corriente, trenzados alrededor de una delgada varilla de vidrio y junto con Katz publicaron sus primeros resultados en 1949; sin embargo, todavía no tenían buenos electrodos de guarda, mantenían la hipótesis del portador y no tenían evidencias claras de la inactivación del sodio.
     Todos esos problemas fueron resueltos en julio de 1949, cuando el equipo fue mejorado, de manera que los experimentos publicados en 1952 fueron hechos durante ese verano. Hodgkin (1992) dice que pudieron resolver los problemas tan rápidamente porque durante mucho tiempo ya habían estado pensando en el tipo de sistema que podría producir un potencial de acción como el registrado en el axón gigante del calamar y también sabían lo que tenían que medir para reconstruirlo.
     Hodgkin, Huxley y Katz todavía pasaron dos años analizando los resultados, parcialmente debido a su frustación al tener que dejar el modelo del portador en el que habían estado pensando durante tanto tiempo y que reemplazaron por una compuerta dependiente de voltaje. Los resultados experimentales fueron publicados en un solo número del Journal of Physiology (1952) y las ecuaciones que las describen en el siguiente número de la misma revista. Para este último trabajo las ecuaciones diferenciales fueron resueltas por Huxley usando una calculadora manual, por lo que los potenciales de membrana (no propagados) tomaban ocho horas, mientras los propagados hasta 3 semanas.
     Varios años después, el comentario de Hodgkin (1977) sobre el trabajo que les valió el Premio Nobel en Fisiología en 1962, fue el siguiente: "As soon as we began to think about molecular mechanisms it became clear that the electrical data would by themselves yield only very general information about the class of system likely to be involved. So we settled for the more pedestrian aim of finding a simple set of mathematical equations which might plausible represent the movement of electrically charged gating particles." Por su parte, Huxley empezó a trabajar en músculo esquelético, un campo al que hizo contribuciones espectaculares y también en 1977 comentó que hizo el cambio porque, "... I felt that it was time to move into another branch of Physiology: for one thing, I had never worked on anything but nerve, and for another, there was at that time (and indeed for a good many years after) no obvious way of pushing the analysis of excitation to a deeper level."
  1   2   3   4   5   6

similar:

Tesis Doctoral iconTesis doctoral

Tesis Doctoral iconTesis doctoral 5

Tesis Doctoral iconTesis Doctoral. Caracas: usr

Tesis Doctoral iconTesis doctoral laureada en la universidad complutense de madrid

Tesis Doctoral iconTesis doctoral Aránzazu Martín García, Madrid España, 2009

Tesis Doctoral iconUna tesis doctoral propone el uso de etanol y de catalizadores heterogéneos...

Tesis Doctoral iconTesis Ad

Tesis Doctoral iconTesis La tesis es la

Tesis Doctoral iconB tesis c monografía

Tesis Doctoral iconTesis doctorals


Medicina



Todos los derechos reservados. Copyright © 2015
contactos
med.se-todo.com