Tesis Doctoral




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1.3.44. Las ecuaciones


     Para describir el inicio y la terminación de la conductancia al sodio, así como el inicio de la del potasio, Hodgkin y Huxley (1952) expresaron los resultados obtenidos durante los experimentos con el control de voltaje en términos de tres parámetros sin dimensiones, n, m,h, que varían entre 0 y 1,. Supusieron que cada uno de estos parámetros obedece una cinética de primer orden,
dn/dt = an (n-n) - bn n

donde an es la tasa de cambio hacia delante y bn la tasa de cambio hacia atrás; en condiciones normales serían solamente funciones del potencial de membrana, V. Para ajustar las ecuaciones a los datos experimentales expresaron la conductancia como,
gK = gK n4   y   gNa = gNa m3h

y escogieron las expresiones analíticas de las a's y b's para proporcionar el mejor ajuste al patrón del análisis de Goldman (1945). En su forma original, para despolarizaciones desde el potencial de reposo, fueron,

an = 0.01(V+10)/(exp((V+10)/10)-1)      bn = 0.125 exp (V/80)

am = 0.01(V+25)/(exp((V+25)/10)-1)     bm = 4 exp (V/18)

ah = 0.7 exp (V/20)     bh = 1/(exp((V+30)/10)+1)


Después estaban las constantes,
gK = 36 mmho/cm2     EK = 12 mV

gNa = 120 mmho/cm2     ENa = -115 mV

y la corriente de fuga, lineal
gL = 0.3 mmho/cm2     EL = -10.6 mV


     Las ecuaciones de H-H son expresiones empíricas de los datos obtenidos durante experimentos con el control de voltaje y producen una representación razonable de ellos. Con esas descripciones de las corrientes iónicas de la membrana como función del potencial de la membrana fue entonces posible regresar y observar la fisiología de un axón en condiciones normales, ya que los factores adicionales son relativamente simples.
     La adición de la capacitancia de la membrana completa la descripción de la corriente a través de la membrana
Im = C dV/dt + Ii


     Estas corrientes y potenciales fueron llamados "de membrana," aunque el término menos ambiguo de "control de espacio" también ha sido usado. Sin embargo, en el axón sin electrodos llegamos a una combinación de la ecuación del cable con las corrientes iónicas, que resulta en un potencial de acción propagado,
(1/(re+ri)) (d2V/dx2) = C (dV/dt) + Ii


     En principio hay soluciones analíticas a esta ecuación diferencial parcial de tipo parabólico, como aquella en la que se hace la suposición de una velocidad constante de propagación. Así, para
V = f (t - x/Ø)

donde Ø es la velocidad del impulso, la solución da

(1/(Ø^2 (re + ri)) (d2V/dt2) = C (dV/dt) + Ii


que es de nuevo una ecuación diferencial ordinaria para el cable, pero ahora conteniendo el parámetro desconocido Ø.
     Además de su uso como expresiones de las corrientes iónicas obtenidas durante experimentos con el control de voltaje, Hodgkin y Huxley interpretaron estos datos como corrientes iónicas de sodio y potasio, con lo que las ecuaciones son una representación formal y completa de la "Teoría del Sodio," reemplanzado las descripciones anteriores, comparativamente cualitativas. Cole (1968) menciona que un título descriptivo más completo del trabajo podría haber sido: "A Theory that a Sodium Ion Permeability, Controlled by the Membrane Potential, is Responsible for the Impulse Excitation and Propagation of the Squid Axon in Its Normal Environment and Under Normal Conditions, with the Hope and Expectation that the Theory Will Apply to Some Other Excitable Cells and Under Some Other Conditions."
     La selección de cinética enzimática para las ecuaciones puede haber sido por conveniencia, pero también está basada en la creencia de que podría corresponder a algún mecanismo intrínseco de la membrana; además, H&H presentaron los parámetros n, m y h como probabilidades de que sitios en la membrana puedan ser activados para permitir la recepción y el paso de los iones. La activación simultánea de cuatro de esos sitios sería necesaria para el paso de iones potasio e, igualmente, se requerirían tres sitios para el paso de iones sodio, pero en este caso también sería necesario desbloquear otro sitio, denominado h, que corresponde a la inactivación.
     Ya que el axón de HH separa los componentes del sodio y potasio de las corrientes iónicas, está postulando mecanismos membranales independientes y por tanto podría considerarse un modelo. Sin embargo, las ecuaciones y el circuito equivalente son expresiones puramente empíricas de los datos experimentales, como las descripciones de dos cajas negras vistas desde el exterior. As’, al no basarse en hipótesis o modelos de los mecanismos internos de la membrana, no pueden considerarse modelos.
     Hodgkin y Huxley (1952d) presentaron como su primer resultado el potencial de acción obtenido en respuesta a un breve estímulo supraumbral, que compararon muy favorablemente con un registro real. Otro parámetro del potencial de acción real también obtenido por Hodgkin y Huxley fue la velocidad de propagación. Para esto superaron el problema de obtener soluciones analíticas para la ecuación no-lineal del cable originada por Kelvin y explicaron que era relativamente más fácil resolver la ecuación si el impulso se propagara a una velocidad uniforme; con esta suposición reescribieron la ecuación, que se convirtió en una ecuación diferencial de 2o orden.

Ii + C dV/dt = (1/K) (d2V/dt2)


     Por supuesto, esta ecuación es mas simple que la ecuación parcial diferencial, de la que es solamente un caso especial, pero la única base para la velocidad constante de propagación era experimental. Sin embargo, por medio de ensayos en los que aproximaron paulatinamente la velocidad al valor constante, Hodgkin y Huxley resolvieron la ecuación hasta un poco más allá del valor máximo del potencial de acción; el resto fue calculado del potencial obtenido durante el control de corriente y el resultado añadido al potencial calculado inicialmente.
     Posteriormente y aunque no estaban tratando de probar la solución obtenida por Hodgkin y Huxley, Cole y cols (1955) repitieron la solución, esta vez en la computadora SEAC. Sin embargo, la medición de la velocidad de propagación del potencial de acción obtenido por las ecuaciones tuvo que esperar hasta que fue posible resolver la ecuación diferencial por medio de su transformación a una ecuación de diferencias (Cooley y Dodge, 1966).

La investigación de la permeabilidad de atravez de la membrana celular comenzó con los experimentos de Hodking y Huxley

MATERIALES Y METODOS.

Descripcion general del setup de patch clamp

Todos los experimentos de electrofisiología fueron realizados con un setup adaptado para conseguir pulsos ultra-rapidos. En primera parte el setup cuenta con una mesa antivibratoria sobre la que se coloca una mesa óptica y sobre esta se montó un microscopio invertido, un sistema neumático de delivery de soluciones, un posicionador micrométrico manual XYZ al que se adosa un piezoelectrico con un cabezal que lleva la pipeta de aplicación. Ademas se coloca un posicionador motorizado XYZ adaptado para que el desplazamiento en la posición Y pueda realizarse en un angulo de 0-90 grados y lleve el headstage de la pipeta de registro. Tambien se coloco un rack de válvulas solenoides (pinch valves) que alternan las soluciones que fluyen por las cañerías del sistema de delivery hacia la pipeta de aplicación. Ademas se montaron sobre el setup sensores electrónicos de presión, un sistema de iluminación para microscopia a base de LEDs ultra brillantes, una cámara web adosada al microscopio, y un sistema de succion de soluciones por vacio. Por ultimo se adapto una lupa de diseccion para monitorear todas las cañerías.

Sistema de delivery de soluciones

El sistema neumático de delivery de soluciones cuenta con un soporte de aluminio para dos pares de jeringas capaz de soportar una presión de XXXXXX. Las jeringas de la parte inferior son cargadas con las soluciones que fluirán el sistema y las de la parte superior están conectadas al sistema de inyección de nitrógeno. Ambas se ubicaron con los embolos contrapuestos y se abrió el sistema de inyección de nitrógeno hasta alcanzar la presión de trabajo deseada. Para evitar picos de presión durante la inyección del gas, que puedan transferirse a picos en la velocidad de los flujos que abandonan la pipeta de aplicacion. El sistema de nitrógeno consta de un tanque maestro cargado a 200 kg/cm3 con una valvula reductora de presión conectada a un tubo que se carga con una presión aproximada de 5kg/cm3, con el que se lleva a la presión deseada a un ultimo tubo que mantiene constante la presión inyectada en el sistema. Este ultimo tubo se conecta a un distribuidor multiple que distribuye la misma presión a todas las jeringas que es monitoreada permanentemente con los sensores electrónicos de presión. Asi, una vez equilibrada la presión de trabajo, las soluciones empiezan a fluir por el sistema a travez de canulas de polietileno PE 50, que se conectaron a canulas de silicona, de diámetro interno XXXXXXX y que son obstruidas por las válvulas solenoides. Luego, las canulas de silicona fueron conectadas nuevamente a las canulas de polietileno y estas a su vez a conectores multiples fabricasos con canulas de silicona de paredes gruesas y diámetro interno XXXXXX, de manera de alternar trenes de solución. Los conectores multiples se conectan a una canula de teflón que es insertada en cada uno de los puertos de la pipeta de aplicación.

Sistema de adquisición de datos (comentar detalles en la sección que corresponda)

Los datos fueron adquiridos empleando un headstage XXXXXX conectado a un amplificador de patch clamp XXXXXX. Las salidas del amplificador fueron conectadas a una placa XXXXXX y esta placa a su vez fue conectada a una computadora. El software empleado para el control de la adquisición como para el control de todos los componentes que interactúan en cada uno de los experimentos fue Labview XXXX

Software JERO.svi

Para realizar los experimentos fue necesario construir un software con una interfaz grafica que permita cotrolar tanto la adquisición de datos como comandar cada una de las partes del setup. A tal fin empleamos el programa LabviewXXXX que me permitió crear dicho programa. La metodología utilizada fue la de construir sub-programas que cumplen funciones especificas, coordinados por un programa general que cuenta con la pantalla de visualización (fig captura de pantalla).La figura XXX muestra un esquema del diagrama de flujo donde figuran las relaciónes entre los sub programas.

  • Barrido todo 21. Es el programa que contiene a todos los otros programas. Posee los controles para la webcam asi como un visor para visualizar el posicionado de las pipetas. Permite seleccionar la información, grafica la evolución de los distintos parámetros y resultados, permite salvar los distintos resultados acorde al experimento que se esta realizando.



  • G_C_fx _fr. General control, custom function & frequencies. Este programa es un generador de funciones que permite generar una función cuadrada una seno y una coseno. Utiliza como parámetros de entrada la frecuencia , la duración del pulso , el tiempo al que comienza el pulso , la amplitud , el numero de muestras , el salto de frecuencias , la frecuencia de inicio y por ultimo el numero de frecuencias .

Para generar la función cuadrada el programa calcula

(1)

Donde Y es la onda cuadrada para = 0, 1, ..., -1, es la amplitud y es calculada por la siguiente ecuación:

(2)

modulo 360 (3)

(4)

(5)

Donde es la frecuencia normalizada expresada en unidades de ciclos/muestra.

(6)

Para generar las funciones trigonométricas el programa calcula una ecuación similar a la ecuación 1

(7)

Donde Y es la función seno para = 0, 1, ..., -1, es la amplitud y , al igual que en el caso de la función cuadrada, es calculada por la ecuación 5, aunque en este caso la

En este caso la frecuencia es calculada como

(8)

De esta forma la frecuencia es calculada a partir de un valor determinado de frecuencia de inicio y se incrementa en cada medición en un salto de frecuencia.

El resultado de este procedimiento es el calculo de una función seno. Esta función seno junto con una coseno, son necesarias para el calculo de la función de transferencia durante la medición del scaneo de frecuencias (sub-programa F_S). El calculo de la función coseno, es similar al del seno solo que esta vez la

Una tercera propiedad de este sub programa es que permite cargar una función contenida en un archivo de texto, cuya amplitud es regulada por el parámetro de entrada de la función cuadrada. Este sub-programa posee además un selector que permite alternar entre cualquiera de las tres funciones posibles y un parámetro de entrada común para las tres funciones posibles que permite realizar un ajuste muy fino en el voltaje entregado al piezo eléctrico por cada una de las funciones, llamado voltaje de sosten o Vholding, que varia el voltaje entregado al piezo en un 1%.

  • T_F. Tunned function. Este sub-programa también es un generador de funciones, que permite generar una función totalmente customizada, que se empleará para mapear la interfaz entre las soluciones que fluyen de la pipeta de aplicación, posicionar la pipeta de registro próxima a dicha interfaz y realizar la calibración del movimiento a través de la interface. Para la construcción de la función emplea como parámetro de entrada un selector del tipo de señal que permite seleccionar el tipo básico de función (triangular, cuadrada o seno), la duración del ciclo de la función, el numero de ciclos, el tiempo al que comienza la función, la duración total, los voltajes máximos y minimos, la frecuencia de muestreo y el voltaje de sosten.



  • AI_AO. Analog imput – analog Outup: Este es el sistema general que controla los distintos elementos del setup (salidas analógicas) y que colecta la información registrada de cada operación (entradas analógicas). Si bien la placa de adquisición permite manejar tanto inputs y outputs analógicos tambien permite controlar canales digitales (entradas o salidas elegidas convenientemente). AI_AO consta de dos líneas de ejucucion una línea que controla las salidas al sistema y otra que controla la adquisición de datos. Ambas líneas tienen creadores de canales físicos que permiten elegir los canales convenientes para cada medición. Además cada una de las líneas posee un reloj que se interconectan por dos parámetros: tasa de muestreo, que determina la cantidad de muestras por canal y por segundo y las muestras por canal que especifican el número de muestras a adquirir o generar en cada tarea en particular.

La línea de outpus analógicos termina por generar una onda para cuna de las tareas asignadas en cada uno de los canales. Por otro lado la línea de inputs analógicos termina con un lector que lee una o mas ondas de lo que se esta registrando en uno o varios canales.

El sub-programa que permite manejar los canales digitales se emplea para el control de las válvulas solenoides y sera descripto aquí dadp que estos deben sincronizarse con los canales analogicos para determinadas mediciones.

  • V_C. Valves commander:



  • F_M_I.



  • Fscan. Frequency Scanning. Este sub-programa permite hacer un escaneo de un rango de frecuencias para las que se calcula como resultado final una función de transferencia que relaciona el voltaje comando (onda sinusoidal) que se le otorga al piezoeléctrico con el movimiento final de la interfaz de las soluciones que fluyen desde la pipeta de aplicación hacia la pipeta de registro. Para tal función utiliza como parámetros de entrada las funciones seno y coseno creadas con G_C_fx _fr y un waveform que aporata los datos temporales y la sincronía con el registro proveniente de la entrada de la función seno al AI_AO. Ademas emplea la amplitud máxima de Y, la amplitud minima de Y, la media máxima y la media minima, Ton, Testedef, Max, Min, Amplitud, ifreq y max Vamp@50K.

El sub-programa fscan tinene a la vez varios sub-programas internos que utilizan algunos de estos parámetros y realizan distintintos cálculos que luego serán convinados por el fscan para visualizar salvar y facilitar la toma de decisiones en cualto a si un registro es valido o no.

  • R_S. Re – Scale: Este sub-programa del fscan permite hacer una recalibracion con el waveform y max Y y min Y

W2=(W-minY)/(maxY-minY)

  • G from waveform: Calcula la función de transferencia tomando el waveform recalibrado (w2), la función seno y coseno. De la función seno se obtiene el intervalo entre dos puntos (dt) y tamben los valores de cada punto (Y). Esto ultomo también se aplica al coseno y al w2 y no se obtiene el dt para eestas por que la base temporal para cada función es la misma. Para cada una de las tres señales se genera un array que cominza en ton/dt y que tiene una longitud (n- (ton/dt)) – (((n- (ton/dt))- (ifreq*dt))*floor (n- (ton/dt))/ (ifreq*dt))) Cada unos de estos arrays es empleado por el siguiente sub programa

  • M_O_G. Measure one G.



  • C_G_W_L . Control G within limits:



Procesamiento de datos

Los datos fueron procesados utilizando programas construidos en Matlab XXXXXX. Los detalles particulares de cada uno de los programas construidos para el analizar los resultados son comentados en las secciones correspondientes

CAPITULO 2

Las condiciones necesarias para obtener aplicaciones ultra cortas de agonista sobre una preparación de outside-out patch clamp fueron analizadas por Fred Sachs (1999). En este trabajo, Sachs propuso algunos limites practicos que pueden influir sobre cuan rápido se pueden intercambiar soluciones sobre una preparación de patch empleando un sistema de perfusion con un tubo tetha, donde la interfase que forman los liquidos que salen de este tubo, es moviva sobre el patch de la membrana alternando entre ambas soluciones. Asi los factores relevantes que controlan la velocidad de respuesta son la velocidad del flujo, la proximidad del patch a los puertos de aplicación, la velocidad con la que cada uno de los jets de solucion puede atravesar el patch, el ancho de la partición entre los jets de solicion y la viscosidad de las soluciones. Entre todos estos factores, el de mayor importancia es la velocidad del movimiento del motor que translada a los los jets de soluciones a través del patch que es proporcionalmente similar a la velocidad con la que la interfase entre las soluciones se mueve sobre el patch.

Aunque muchos son los dispositivos que suelen adosarse a la pipeta de aplicación como válvulas solenoides o arreglos de estas, usualmente suelen emplearse como motor para el movimiento de la interfase un piezo eléctrico (jonas 1995)






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