Tesis Doctoral




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4 Pulsos ultra cortos

4.1 Introduccion.

El estudio cinético de la activación de canales ionicos activados por ligando depende de la habilidad para aplicar el ligando sobre una preparación de outside-out patch clamp que contenga dicho canal. Muchos son los métodos que se han diseñado para lograr aplicaciones cortas de agosnista entre los que se encuetra técnicas de fotoliberacion y técnicas hidráulicas [1, 2], aunque la mayoría de estas técnicas presentan limitaciones importantes. Por un lado la foto-liberación tiene tiempos de liberación muy rapidos, pero requiere de síntesis de compuestos que pueden resultar toxicos para el patch. Ademas es difícil conocer la concentración del agonista durante el pulso y la solución con el ligando del canal ionico debe ser lavada para generar un pulso de aplicación con una constante temporal mucho mas lenta que la de la liberación [3, 4]. Por otra parte las técnicas hidráulicas no requieren síntesis de compuestos especiales y se puede determinar fácilmente la concentración de agonista que llega al patch, dado que estas se basan en mover una interfaz muy delgada generada entre dos soluciones que fluyen muy próximas entre si. El movimiento de la interfaz puede darse por interrumpir abruptamente uno de los flujos empleando por ejemplo una valvula solenoide (ver capitulo anterior), o por desplazamientos realizados con un piezo eléctrico [5, 6]. Estos dispositivos intercambiadores tienen rise time cercanos a los de la foto-liberacion. El estado de arte de estos dispositivos muestra que pueden lograrse aplicciones de 200 µs [7] o 400 µs [8]. Los dispositivos disponibles comercialmente pueden generar pulsos de hasta 1ms. Estos pulsos son demasiado largos para estudiar la cinetica de receptores muy importates como los receptores de acetilcolina (AChR), con una constante de gaiting de 100 µs, o los receptors  ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPAR), que dependiendo del subtipo tienen constantes de gaiting de 12-100 µs [3, 4].|

Por otra parte pulsos de esa duración tampoco permiten discriminar estados parciales de activación (Flip State), en receptores que se activan con una cinetica mas lenta, como es el caso de los receptores purinergicos de la familia P2X [7]

En este capitulo analizare las variables que pueden afectar la aplicación ultrarapida de agosnista sobre un canal. Teniendo en cuenta que las funciones de transferencia describen las vibraciones generales del sistema, las variables analizadas no solamente fueron las del piezo eléctrico sino también las concernientes al sistema de flujos, incluyendo a las soluciones y a la pipeta de aplicación.

4.2 Investigando el frente de las soluciones.

Con el fin de encontrar cuales son las condiciones que maximizan las posibilidades de encontrar pulsos ultracortos, investigue el comportamiento de las soluciones que fluyen a partir de la pipeta de aplicación. A tal fin el diseño experimental fue el que se muestra en la figura 4.1.









5 “Barrido de frecuencias”

    1. Introducción.

Durante los capítulos anteriores describi como realice pulsos ultra rapidos de aplicaciones de soluciones y cuales fueron las estrategias usadas para crear el setup experimental y los métodos de control. Ademas comente cuales fueron las variable que hubo que corregir para obtener dichos pulsos.

Si bien la creación de pulsos ultra cortos fue un novedoso hallazgo, este generó nuevos desafíos, por un lado la cinetica de algunos canales (gaba C) debe ser estudiada aplicando pulsos de concentración mas largos ya que estos se abren muy lentamente. En este punto solo logre obtener por el método de los pulsos ultrarapidos, pulsos de 20 - 100 microsegundos de duración de forma confiable. Por otra parte un segundo desafio fue la creación de pulsos repetidos de una duración determinada y saparados por intervalos constantes o variables. Un tercer desafio fue la generación de trenes de pulsos totalmente aleatorios. De esta manera busque cubrir todas las posibilidades practicas para el análisis cinético de la activación de cualquier tipo de receptor. Los análisis cinéticos serán comentados en secciones posteriores.

    1. Construccion de una función de transferencia para cada frecuencia.

La construcción de una funcion de transferencia para cada una de las frecuencias posibles de movimiento del piezoeléctrico fue realizada con el sub-programa Fscan el cual entrega un voltaje comando al piezo eléctrico con forma de coseno y va incrementando la frecuencia de esta función en una cantidad determinada por el salto de frecuencia, siempre y cuando la frecuencia anteriror haya sido considerada como correcta (para mas detalles del funcionamiento del sub-programa Fscan ver la sección de 2.4 de Materiales y métodos).

El rango de frecuencias analizado fue de 1KHz a 65 KHz, con un salto de frecuencias de 100 Hz. Saltos de frecuencia menores también fueron analizados pero las funciones de transferencia no variaron considerablemente como para suponer que, pasajes de frecuencia mas cortos, aportan mas información de las vibraciones del sistema. Dentro del rango de análisis de frecuencias el tiempo de registro para cada una de las frecuencias fue 0.3 ms, generando 300 registros para el movimiento del piezo en 1 KHz que fueron incrementándose a razón de 30 registros por salto de frecuencia hasta llegar a 19500 registros para 65 KHz. En cada uno de los saltos de frecuencia el valor de los registros fue promediado y fue aceptado si estaba dentro de los limites prefijados tanto de amplitud como de posicionamiento entre el 40-60% de la interfase.

Frecuencias menores a 1KHz fueron descartadas ya que solo reflejaron el ruido de línea y la adquisición de los datos se torna extremadamente engorroso, dado que para adquirir como minimo 300 registros debe subdividirse el rango de frecuenias e incrementar el tiempo de registro, llegando a 300s de registro para 1 Hz. Asi se obtuvo un valor de la función de transferencia para cada una de las frecuencias de interés. Cuando se llego a la frecuencia final la función fue salvada y se la utilizó para calcular los distintos voltajes comandos.

Para evaluar si la función de transferencia es propia del sistema o es independiente en cada una de las mediciones, se montó todo el dispositivo experimental y se realizaron varias mediciones consecutivas de la función de transferencia. La figura 5.1 muestra que las distintas mediciones de la función de transferencia reflejan fielmente el comportamiento del sistema experimental.

Por otra parte analice la repetitividad de los resultados al desarmar el sistema y volverlo a armar. Tal como refleja la figura 5.2 las vibraciones del sistema son diferentes al armar y desarmar, aunque conservan ciertas frecuencias características.

Para saber si la función de transferencia permite obtener pulsos ultracortos de 20 us compare las funciones de transferencia obtenidas para todas las frecuencias con el método Fscan con la que se calculó para el pulso único de la misma duración. La superposición de las funciones de transferencia muestran que ambos métodos generan funciónes que se superponen, pero la función para el pulso muestra contamiacion del movimiento (Figura 5.3). En la sección siguiente se muestran como se superponen los voltajes comandos de estas dos funciones de transferencia.

Fig 5.1. funciones de transferencia de distintos días vs armado y desarmado.

Fig 5.2 Funciones de transferencia con el fscan y con el pulso superpuestas 1KHz a 65KHz

Fig 5.3. Pulso de 20 us por ambos métodos y pulsos de 100 por ambos métodos (con vouts)

Fig 5.4. Pulso de 10 ms con vibraciones (con Vouts)

Fig 5.5. función de transferencia de 100Hz a 65 KHz

Fig 5.6. comparación de Vouts de distintas diracion

Fig 5.7. pulsos de distintas duración. Comparacion de rise time y decay time

Fig 5.8. pulsos de duración constante y separación aleatoria (Vouts y pulsos)

Fig 5.9. pulsos totalmente aleatorios.

5.3. Calculo del voltaje comando.

    1. Pulsos de distinta frecuencia.

    2. Crean do pulsos aleatorios.

Referencias.

1. Maconochie, D.J. and D.E. Knight, A method for making solution changes in the sub-millisecond range at the tip of a patch pipette. Pflugers Arch, 1989. 414(5): p. 589-96.

2. Breitinger, H.G., Fast kinetic analysis of ligand-gated ion channels. Neuroscientist, 2001. 7(2): p. 95-103.

3. Li, H., et al., Mechanism of glutamate receptor-channel function in rat hippocampal neurons investigated using the laser-pulse photolysis (LaPP) technique. Biochemistry, 2002. 41(15): p. 4753-9.

4. Li, G., W. Pei, and L. Niu, Channel-opening kinetics of GluR2Q(flip) AMPA receptor: a laser-pulse photolysis study. Biochemistry, 2003. 42(42): p. 12358-66.

5. Komal, P., G. Evans, and R. Nashmi, A rapid agonist application system for fast activation of ligand-gated ion channels. J Neurosci Methods, 2011. 198(2): p. 246-54.

6. Jonas, P., Fast application of agonists to isolated membrane patches., in Single-channel recording., B. Sakmann and E. Neher, Editors. 1995, Plenum Press: New York. p. 231–243.

7. Moffatt, L. and R.I. Hume, Responses of rat P2X2 receptors to ultrashort pulses of ATP provide insights into ATP binding and channel gating. J Gen Physiol, 2007. 130(2): p. 183-201.

8. Botzolakis, E.J., et al., Achieving synaptically relevant pulses of neurotransmitter using PDMS microfluidics. J Neurosci Methods, 2009. 177(2): p. 294-302.

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