Practica n° 4 de análisis por instrumentacióN




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títuloPractica n° 4 de análisis por instrumentacióN
fecha de publicación26.12.2015
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PRACTICA N° 4 DE ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN



MANTENIMIENTO Y CALIBRACION DE ESPECTROFOTOMETROS UV-VIS
La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, construido mediante procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia.

El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.
MANTENIMIENTO DEL ESPECTROFOTOMETRO.

Los espectrofotómetros, en general, son equipos muy especializados y costosos. Su conservación depende en gran medida de la forma de instalación y utilización. El medio ambiente que los rodea y la calidad de los servicios de electricidad constituyen factores de primordial importancia, para que los equipos puedan prestar los servicios de acuerdo con las especificaciones para los que fueron fabricados. Las rutinas de mantenimiento que pueden llegar a requerir varían en complejidad, van desde la limpieza cuidadosa de sus componentes hasta procedimientos especializados, que solo deben realizar técnicos o ingenieros que hayan recibido la capacitación correspondiente y dispongan de la información técnica desarrollada por los fabricantes.

El mantenimiento preventivo del espectrofotómetro debe responder a las rutinas y frecuencias recomendadas por el fabricante.
A continuación, se presenta un grupo de rutinas básicas que puede ser realizada en el laboratorio.
1. Limpiar externamente el espectrofotómetro, incluyendo los controles, pantallas o metros de medición. Esto se puede realizar con una pieza de tela fina –similar a la textura de los pañuelos– humedecida con agua destilada.

2. Inspeccionar y limpiar el cable de alimentación eléctrica.

3. Verificar que la lámpara esté limpia y en buen estado. Si no funciona, instalar una nueva, con las mismas especificaciones de la original. En los espectrofotómetros modernos, el estado de la lámpara es detectado automáticamente mediante el software que controla el estado y el funcionamiento del equipo, por lo que es fácil determinar en qué momento es necesario cambiar la lámpara. Efectuar el cambio de la lámpara y realizar el ajuste posterior siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante.

4. Revisar el fusible de protección. Antes de abrir el alojamiento del fusible, comprobar que el espectrofotómetro esté apagado y que sus contactos se encuentren limpios y en buen estado. Si es necesario reemplazarlo, colocar uno nuevo con las mismas características del recomendado por el fabricante.

5. Colocar el instrumento en la configuración operacional.

6. Accionar el interruptor de encendido para permitir un funcionamiento por cinco (5) minutos. Verificar lo siguiente:

a) Si las lámparas o indicadores piloto funcionan.

b) Si el indicador de lectura permanece en cero (0).

c) Si la luz de la fuente funciona.

7. Realizar una prueba de corriente de fuga en las posiciones de encendido y apagado.

a) Verificar el polo a tierra y la polaridad correcta.

b) Verificar la polaridad correcta sin polo a tierra.

c) Verificar la polaridad inversa sin polo a tierra.

8. Calibrar el panel frontal del espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.

9. Medir la sensibilidad del equipo.

10. Realizar una prueba siguiendo la ley de Beer.

11. Regresar el espectrofotómetro a la configuración inicial, si la calibración se ha efectuado con éxito.

BUENAS PRÁCTICAS DE USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO
1. Efectuar la calibración del espectrofotómetro, cada vez que se realiza el análisis de un grupo de muestras.

2. Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el proceso de medición, para asegurar una lectura adecuada.

3. Evitar reutilizar las cubetas desechables.

4. Utilizar únicamente cubetas de cuarzo, para efectuar análisis por debajo de los 310 nm.

5. Evitar el uso de cubetas plásticas, si se utilizan solventes orgánicos.

6. Utilizar cristalería de boro silicato de alta calidad para preparar los estándares. Evitar el uso de cristalería de sodio –óxido de sodio– siempre que sea posible, debido a que el contacto prolongado con los estándares puede permearla y, en consecuencia, producir resultados erróneos.

7. Limpiar cuidadosamente las cubetas de vidrio después de utilizarlas. Desechar aquellas que presenten rayones en la superficie pulida.

8. Utilizar en lo posible reactivos de alta calidad. Reactivos de baja calidad pueden causar contaminación incluso en concentraciones muy bajas. Los diluyentes utilizados –agua o solventes– deberán estar libres de impurezas.

9. Verificar que las muestras o estándares no se han desgasificado dentro de las cubetas.

Este fenómeno produce burbujas sobre la superficie interna de las cubetas y errores en las lecturas.

10. Tener en cuenta, cuando se pretenda utilizar nuevos procedimientos, que no todas las sustancias cumplen con la ley de Beer. Efectuar pruebas de linealidad sobre el rango de concentraciones a ser utilizadas. Se recomienda preparar un grupo de soluciones fuertes –conocidas– y verificar los Espectrofotómetro

11. Resultados. Los fenómenos que afectan la ley de Beer son los siguientes:

a) Las altas concentraciones por asociación molecular de especies iónicas.

b) Variaciones en la hidratación a bajas concentraciones producen cambios en la naturaleza de los iones complejos

PRACTICA N° 5 DE ANÁLISIS POR INSTRUMENTACIÓN



ESPECTROFOTOMETRIA – CURVA DE CALIBRACION
Introducción
Al observar una solución acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloración, la cual se debe a la interacción entre las moléculas del colorante y la luz que atraviesa la disolución. Además en caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un gradiente de concentración a partir de la intensidad de la coloración. Estas observaciones dan origen a una serie de prácticas analíticas llamada Espectrofotometría, basada en la interacción de las moléculas y las radiaciones electromagnéticas.
Una radiación electromagnética se puede describir como un flujo de partículas llamadas fotones, o bien como una onda propagándose en el espacio. De esta última descripción se toma el concepto de longitud de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos consecutivos de la onda. La longitud de onda es inversamente proporcional a la energía de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones electromagnéticas abarca un amplio rango de energías, las de menor energía son las ondas de radio y las de mayor energía son las llamadas radiación gamma.


El estado energético de una molécula se puede alterar por la absorción de radiación electromagnética a determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cuali o cuantitativo, este fenómeno es el fundamento de la espectrofotometría. Cuando un haz de luz incide sobre un medio homogéneo parte de la radiación es absorbida y parte transmitida, la fracción de luz que se absorbe y se transmite dependerá de la cantidad de moléculas presentes en el medio (de la concentración) los que nos permite cuantificar una sustancia
Las principales ventajas de la espectrofotometría son:

  • Sensibilidad relativa elevada.

  • Facilidad para realizar mediciones rápidas.

  • Grado de especificidad relativamente elevado.


Para obtener la máxima sensibilidad en una determinación debe conocerse la longitud de onda de mayor absorción de la sustancia analizada, que no deberá coincidir con una alta absorción de otras sustancias presentes en la reacción.
Sea I la intensidad de una radiación que atraviesa un medio homogéneo, parte de la radiación es absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera que se define transmitancia de una muestra como la relación entre la radiación transmitida i versus la intensidad luminosa incidente I, multiplicado x 100:
% T = ( i / I) x 100

La absorbancia es una medida de la cantidad de Energía luminosa incidente absorbida por una sustancia en solución. Está relacionada con Transmitancia por medio de :
A= - Log T A= log ( 100 / %T)
La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solución es directamente proporcional al camino recorrido por la radiación electromagnética y a la concentración de la solución.

A= abc


A: absorbancia

a: absortividad específica de cada soluto

b: distancia recorrida por el haz de luz en cm

c: concentración de la solución

La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuación, sus unidades dependerán de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b está en centímetros y c en moles por litro, la absortividad estará en litros / mol centímetro y se denomina coeficiente de absorción molar (E).
Requerimientos para poder aplicar la Ley:

- La medición del % de T es realizada con luz monocromática


- La medición del % de T es realizada a una región de absorción del componente a estudiar.

- La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0%

- La naturaleza de la solución debe ser tal que su transmisión responda a variaciones de C.


Espectrofotómetro


Los aparatos de medida de la absorción de la radiación electromagnética se denominan espectrofotómetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:

La luz procedente de la fuente se hace pasar a través del monocromador, que la desdobla en haces monocromáticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y según su abertura se obtiene luz de una determinada longitud de onda.La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la posición del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide sobre el fototubo, donde se detecta. La señal se envía a un registrador, el cual puede ser la escala de un galvanómetro calibrado.
Calibración del espectrofotómetro

Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen temperatura.

Elegir la longitud de onda deseada con el selector.

Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo

Espectro de absorción

Consiste en un gráfico que representa el % T o la Absorbancia en función de la Longitud de onda a la cual se realiza la medición, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentración c de la muestra.

Permite determinar las longitudes de onda óptimas de absorción y las concentraciones adecuadas de trabajo. La longitud de onda optima será aquella en el que el valor de absorbancia sea máximo
Los pasos para realizar un espectro de absorción son:

Seleccionar la longitud de onda.

Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.

Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.

Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.

Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea máxima.

Curva de calibración
Permite determinar la concentración de una muestra incógnita. Consiste en medir una serie de soluciones concentración conocida de la sustancia de la muestra incógnita. Se grafican esos puntos y se emplea dicho grafico para calcular la muestra problema.


Los pasos para realizar una curva de calibración son:

Medir la A de las soluciones de concentración conocida.

Medir la A de la muestra problema.

Graficar Absorbancia vs concentración.
Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el gráfico será una recta y será posible sacar un factor ya que la pendiente de la recta será la misma en todos los puntos. Así se podrá calcular la concentración de la muestra problema.
Si la sustancia no cumple la Ley, el gráfico será una curva y se extrapolará dentro de un rango apropiado para calcular el valor de la muestra problema.
Parte experimental
Objetivos

- Aprender el uso del espectrofotómetro.

- Realizar espectro de absorción de sustancias puras: soluciones de azul de metileno.

- Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de una muestra problema de azul de metileno.
Actividades:


  1. Espectro de absorción de solución de azul de metileno


Utilizar la solución de azul de metileno de 5mg/l.Llevar a cero de absorbancia con agua destilada antes de realizar cada lectura en el espectrofotómetro. Medir las absorbancias a distintas longitudes de onda, con intervalos de 20 nm, desde 500 nm hasta 700 nm y cada 10 nm entre 600 y 700 nm.

Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.

Observar cuál es la longitud de onda de mayor absorción que se utilizará para realizar la curva de calibración y determinar la concentración de una muestra problema.
2- Curva de calibración
A partir de la solución patrón de 5 mg/l realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10; 1/15. Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar absorbancia versus concentración.

Determinar con la gráfica anterior la concentración de la muestra problema.
Problemas
1- El coeficiente de absorción específico de una proteína es de 6 dl/g.cm. Calcúlese la concentración en mg/ml si una solución de ésta presenta una absorbancia de 0,82 en una cubeta de 1 cm .

2- Un barbitúrico presenta un máximo de absorbancia a 245 nm en un medio fuertemente alcalino. Trabajando con una celda de 1 cm de espesor se obtienen los siguientes datos:

concentración (M) Absorbancia

2,05 x 10-5 0,179

4,10 x 10-5 0,356

8,20 x 10-5 0,718

16,40 x 10-5 1,430

Determinar si cumple la ley de Lambert y Beer.
3- Calcule la concentración de una solución de ATP que posee una absorbancia de 0,87 a 259 nm,si el coeficiente de absorción molar a pH 7,0 es de 15,4 l/molcm y la longitud de paso de la cuba es de 1cm. Cuál será la absorbancia de una solución de ATP de concentración 10g/L?. PM ATP: 491
4- Una solución que contiene 2 gr/l de una sustancia, transmite el 75% de la luz incidente en una cubeta de 1 cm a una determinada longitud de onda. Calcular la transmitancia de una solución que contenga 4 gr/l y la absorbancia de una solución que contenga 6 gr/l.
5- Al realizar un espectro de absorción de proteínas, se encontraron las siguientes absorbancias:

Longitud de onda (nm) Abs

240 0,100

250 0,099

260 0,170

270 0,245

280 0,290

290 0,198

300 0,171

310 0,115

Graficar y determinar la longitud de onda que utilizaría para medir proteínas.
6- Calcular la concentración de una muestra problema de hemoglobina sabiendo que presenta a 540 nm una absorbancia de 0,45. En la curva de calibración se obtuvieron los siguientes datos:

Absorbancia Concentración ( g/ dl)

0,37 11

0,404 12

0,438 13

0,472 14

0,505 15

Determinar si el compuesto cumple con la Ley de Lambert y Beer a esa longitud de onda.
7- En una muestra de suelo se determinó nitritos por un método colorimétrico. La absorbancia de la muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibración se encontraron los siguientes valores:

Absorbancia Concentración ( ug/ ml)

0,23 0,20

0,47 0,40

0,65 0,60

0,90 0,80

Determinar la concentración de nitritos en la muestra.

Es posible sacar un factor para determinar nitritos en próximas muestras?. Justificar.





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