Año 2012 Química Biológica I tpnº 2




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fecha de publicación23.01.2016
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Año 2012 - Química Biológica I - TPNº 2:
Estructura de proteínas

Objetivos del práctico

Reforzar los conocimientos básicos sobre estructura de proteínas brindados en la clase teórica.

Familiarizarse con el uso de programas de visualización molecular.

Luego de este práctico deberá comprender:

La relación de los ángulos  (phi) y  (psi) con la estructura de una cadena polipeptídica.

Los distintos tipos de estructura secundaria presentes en las proteínas.

La distribución diferencial de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos en las proteínas.

La relación estructura-función para la hemoglobina humana.

Introducción

Las estructuras atómicas de más de 80.000 biomoléculas han sido determinados y sus coordenadas depositadas en una base de datos denominada Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Dada la fuerte relación que existe entre la estructura y la función, estas estructuras permiten entender la biología celular a un nivel atómico y dan herramientas para controlar tecnológicamente su función. Por ejemplo, casi todas las enzimas involucradas en la producción de energía celular (glicólisis, ciclo del ácido cítrico y transporte de electrones) han sido estudiadas y sus estructuras determinadas. También se conocen estructuras tridimensionales de diversas proteínas involucradas en la señalización celular, transporte, regulación y defensa.

El conocimiento de las estructuras moleculares de las proteínas permite numerosos desarrollos tecnológicos, principalmente en la industria farmacológica como por ejemplo:

Descubrimiento y diseño de nuevas drogas: Una de las aplicaciones mas importantes de la estructura biomolecular es el diseño de fármacos. El conocimiento de la estructura de una proteína nos permite intentar diseñar pequeñas moléculas que se unan a la misma, bloqueando o exacerbando su función. La potencialidad de esta aproximación quedó demostrada en la lucha contra el VIH y el SIDA (Prevelige, 2011). Muchas de las drogas anti-VIH actualmente en uso fueron obtenidas a través de programas de desarrollo inteligente de fármacos.

Diseño de nuevas nano-máquinas o nano-herramientas: las estructuras biomoleculares han abierto una nueva disciplina de la ingeniera biomolecular y la bionanotecnología. De la mano de la comprensión viene el control, y los investigadores se encuentran actualmente modificando biomoléculas existentes para obtener nuevas funciones e incluso diseñando nuevas biomoléculas. Por ejemplo, se están construyendo estructuras a nanoescala con DNA.

Bioterapéutica, enzimas industriales: muchos bioterapéuticos han sido desarrollados con la ayuda de los modelos 3-D de proteínas. El diseño, construcción y humanización de anticuerpos ya es una rama desarrollada de la biotecnología, asimismo se pueden diseñar fragmentos pequeños de anticuerpos con actividad biológica, aumentar su especificidad, su afinidad o su vida media. Las enzimas son ampliamente usadas en la industria y en la biotecnología, son componentes de jabones, detergentes y empleadas para la elaboración de pan, vino, jugo de frutas y para el tratamiento de telas, papel y cuero. Su uso permite ahorrar agua, energía y evita el empleo de compuestos químicos que pueden resultar nocivos para el medio ambiente y la salud humana. El modelado de las enzimas permite el entendimiento de sus propiedades biofísicas para luego modificarlas y obtener moléculas con propiedades biológicas optimizadas para el uso que se pretende darle o con alta estabilidad a la oxidación, a las altas temperaturas, a la alta fuerza iónica o con mejor especificidad por un sustrato.

Determinación de las estructuras moleculares

Entre las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de proteínas se dispone actualmente de métodos experimentales y métodos biocomputacionales (teóricos pero que obtienen sus datos de la experimentación). Entre los métodos experimentales podemos diferenciar los métodos de alta y de baja resolución. Los de alta resolución son la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear. Proveen las coordenadas (x,y,z) de cada átomo, pero presentan la desventaja de ser técnicas de alto costo operativo y no dan información dinámica (es decir los cambios que va sufriendo una biomolécula, por ejemplo durante una reacción química o unión a un ligando). Las técnicas de baja resolución en cambio son de bajo costo operativo, dan información global del sistema y pueden ir midiendo los cambios estructurales con el tiempo. La microscopía electrónica y la dispersión de Rayos X a ángulo bajo (SAXS) dan información de la forma de la molécula pero no coordenadas atómicas. El dicroísmo circular (DC) y la espectroscopía infrarroja (IR) son muy útiles para determinar el contenido de cada tipo de estructura secundaria que hay en una proteína. Es importante destacar que las técnicas de alta y baja resolución son complementarias entre si, pues para comprender un sistema es fundamental no sólo conocer la distribución espacial de sus átomos sino también seguir su movimiento. Las técnicas de DC, IR y espectroscopia de fluorescencia son muy útiles para determinar interacciones entre proteínas, subunidades proteicas, para monitorear cambios en función del tiempo y para estudiar el plegamiento de las proteínas. La Figura 1 muestra la complementariedad escalar, es decir a que escala podemos aplicar los diferentes métodos.



Figura 1: Representación esquemática de la resolución obtenida con las diferentes técnicas para la obtención de estructuras de proteínas.

Técnicas de alta resolución:

  • Cristalografía de rayos-X: permite determinar la ubicación de cada átomo en la molécula. La biomolécula de interés es purificada, cristalizada y entonces el cristal es sometido a un intenso haz de rayos-X (a menudo, provistos por un sincrotrón). Los rayos X son difractados en un arreglo característico de manchas. Analizando el espaciado y la intensidad de estas manchas, se puede determinar como se acomodan las moléculas en el cristal y donde se ubica cada átomo.

  • Espectroscopía RMN: revela las distancias entre los átomos en una biomolécula, así como también la conformación local de porciones de cadenas macromoleculares. Esta información es usada para inferir la estructura de las biomoléculas. Actualmente, la espectroscopía de RMN es efectiva para determinar la estructura de moléculas orgánicas pequeñas y proteínas u oligonucleótidos de baja masa molecular, ya que las mediciones experimentales son difíciles o imposibles de llevar a cabo para moléculas grandes.

Técnicas de baja resolución:

  • Microscopia electrónica: es efectiva para estructuras muy grandes, tales como virus o ensambles proteicos tales como el poro nuclear. Las ópticas usadas para enfocar los electrones no son lo suficientemente precisas para resolver los átomos individuales, pero la microscopía electrónica puede dar una buena aproximación de la forma general de las estructuras subcelulares. Es una herramienta poderosa usada en combinación con las técnicas de resolución a nivel atómico mencionadas antes (cristalografía de rayos X y RMN).

  • Dispersión de Rayos X a ángulo bajo (SAXS): La dispersión de rayos X a bajos ángulos, o SAXS (Small Angle X-ray Scattering) es una técnica basada en analizar la dispersión de rayos X producida por un material al paso de un haz de rayos X a ángulos muy próximos a cero. Cualquier evento de dispersión está caracterizado por una ley recíproca entre tamaño de partícula y ángulo de dispersión. La radiación electromagnética incidente interactúa con los electrones en una muestra. Una parte de ellos emitirá radiación coherente. En el lugar donde las ondas interfieran constructivamente tendremos un máximo, que es lo que detectamos. Del análisis matemático de las interferencias constructivas podemos obtener la forma global de una proteína.

  • Dicroismo Circular (DC): es una técnica espectroscópica de absorción que provee información acerca de la estructura de macromoléculas biológicas. La señal medida en DC es la diferencia entre las Abs (A) de la luz polarizada circularmente hacia la izquierda (l) y hacia la derecha (r): DC = A(r) - A(l)

Se utiliza como fuente luz polarizada (UV-VIS) y las muestras a analizar, además de absorber, deben ser ópticamente activas. DC es una de las técnicas más sensibles para determinar las estructuras secundarias y monitorear cambios en dicha estructura. El cromóforo en el UV lejano (180 a 250nm) es el enlace peptídico; y en el UV cercano (250 a 350nm) son los residuos aromáticos, Tyr, Trp y Phe, y el puente S-S de Cys. El DC en el UV lejano permite obtener medidas empíricas de los elementos de estructura secundaria de la proteína y en muchos casos se puede obtener la proporción de cada uno de ellos que se encuentra presente (es decir % de α-hélices, hojas β, giros β y random coil). La intensidad en el cercano es mucho menor que en el lejano por lo que se requiere mayor concentración de proteína. Esto es debido a que en una proteína hay menos residuos aromáticos que enlaces peptídicos. El espectro de DC en el UV-cercano depende del plegamiento de la proteína (estructura terciaria) y es como una huella dactilar de la misma en condiciones nativas (plegada). Esto implica que este método es útil para saber si la proteína está correctamente plegada. También se puede seguir el cambio conformacional provocado por algún ligando que se una a un residuo aromático.

  • Espectroscopia infrarroja (IR): proporciona información sobre el contenido de estructura secundaria de proteínas y péptidos, ya que los mismos presentan un conjunto característico de bandas de absorción en su espectro. Las bandas características encontradas en un espectro IR de una proteína son las bandas amida I y amida II. La absorción asociada a la banda amida I depende de las vibraciones de estiramiento del enlace C = O (figura 2), en cambio la banda amida II depende principalmente de las vibraciones de flexión del enlace N-H. Debido a que tanto el C = O y los enlaces N-H están implicados en el enlace de hidrógeno que tiene lugar entre los diferentes elementos de estructura secundaria, las ubicaciones en el espectro de ambas bandas depende del tipo de la estructura secundaria presente en la proteína. Estudios con proteínas de estructura conocida se han utilizado para correlacionar la forma de la banda amida I con el contenido de estructura secundaria.

Figura 2: vibraciones de los enlaces responsables de las bandas de absorción en el espectro IR de las proteínas.

  • Espectroscopia de Fluorescencia: es el método espectroscópico óptico más utilizado en determinaciones analíticas y para la investigación científica. Se aplica, entre otras cosas, para estudiar los procesos físicos fundamentales de las moléculas, la relación entre la estructura y la función e interacciones entre biomoléculas (por ejemplo entre una proteína y un ácido nucleico, entre dos proteínas o entre una proteína y un ligando). El estudio de la fluorescencia de los aminoácidos aromáticos, principalmente Trp y Tyr puede dar mucha información del entorno en el que se encuentran los mismos y de la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas cuando se las somete a diferentes perturbaciones. Al tener un alto nivel de sensibilidad se pueden estudiar las proteínas en soluciones muy diluidas y su amplio rango dinámico (hay equipos que pueden hacer determinaciones en tiempos extremadamente cortos) permite realizar estudios de plegamiento o de interacción con ligandos en función del tiempo. Otra gran ventaja es que se puede aprovechar la fluorescencia intrínseca de las proteínas (de los residuos Trp y Tyr) y realizar estudios dinámicos con la proteína sin modificaciones.

Técnicas Biocomputacionales:

  • El dogma central que fundamenta la modelización teórica de proteínas a partir de su secuencia se basa en que “la estructura tridimensional de una proteína está determinada sólo por su secuencia y por las características del entorno, sin la participación obligatoria de factores externos”. Existen numerosos métodos que van desde el modelado “de novo” de una proteína hasta los que utilizan como molde una proteína de la misma familia cuya estructura está ya resuelta. Estos métodos tuvieron un desarrollo exponencial en la última década y permiten obtener mucha información útil cuando esta es inaccesible para las técnicas experimentales.

Acceso a la información sobre estructuras de proteínas

Toda la información estructural derivada de las técnicas de alta resolución ha sido cuidadosamente almacenada en una gran base de datos, el PDB. Desde 1971 los investigadores depositan allí sus resultados los que son cuidadosamente revisados antes de ser aceptados. Hoy en día, hay más de 80.000 estructuras y para consultarlas se puede visitar su sitio web: http://www.pdb.org/pdb/home/home.do

Visualización de las estructuras atómicas

La información que depositan los autores en PDB debe estar en el formato de la figura 3. Para poder manejar esta información, se necesita un software adecuado que represente espacialmente a cada átomo según sus coordenadas. Actualmente existen numerosos programas de visualización molecular. Entre los más utilizados para la generación de gráficos profesionales como los que encontramos en publicaciones científicas y libros de texto podemos nombrar Rasmol, PyMOL y VMD. Para observar los distintos detalles de las estructuras de proteínas haremos uso del programa Mage, que se encuentra especialmente adaptado para su uso en docencia. (Recomendamos que lo bajen antes del trabajo práctico para facilitar el estudio). Alternativamente se puede utilizar el programa King que es una versión Java (multiplataforma) del mismo. Los mismos pueden ser descargados de:

http://kinemage.biochem.duke.edu/software/index.php.

Este programa nos permitirá navegar a través de tutoriales personalizados para repasar los conceptos básicos de estructura de proteínas y estudiar la relación entre estructura y función de la hemoglobina humana. Los archivos de tutoriales pueden descargarse de la página de la cátedra (http://www.qbiologica.ecaths.com/trabajos-practicos/).



Figura 3: Vista de un archivo pdb. En el rectángulo resaltado se pueden ver las coordenadas atómicas (x,y,z) de los átomos de cada aminoácido y también de átomos no pertenecientes a la proteína (heteroátomos).

PARTE PRÁCTICA:

Conceptos básicos de estructura de proteínas (tutorial: practico_A.kin)

Fragmento polipeptídico: ángulos de rotación  (phi),  (psi) y  (omega)

El esqueleto de la cadena polipeptídica de las proteínas está formado por los enlaces entre los átomos de nitrógeno (N), el carbono α (Cα) y el carbono del carbonilo (C’) pertenecientes a un residuo de aminoácido y continua uniéndose mediante enlace peptídico el C’ con el N del siguiente residuo de aminoácido. La figura 4-A muestra un fragmento de la cadena polipeptídica, para ilustrar su geometría, los nombres de los átomos y los ángulos diedros o ángulos de torsión de la cadena principal (,  y ). Los ángulos diedros  (que involucra los átomos C’i-1-Ni-Cαi-C’i alrededor del enlace Ni-Cαi; es decir, es el ángulo entre el plano que contiene los átomos C’i-1-Ni-Cαi y el plano que contiene los átomos Ni-Cαi-Ci’) y  (Ni-Cαi-C’i-Ni+1 alrededor del enlace Cαi-C’i) moldean la estructura tridimensional de la proteína. En la figura 4-B y 4-C se muestran las proyecciones de Newman (Nič, Jirát, Košata, Jenkins, & McNaught, 2012) de los enlaces Ni-Cαi y Cαi-C’i, respectivamente, mostrando los ángulos  y . Por convención, cuando el ángulo de torsión debe tener un valor absoluto < a 180º y se mide en el sentido de las agujas del reloj es positivo y en sentido inverso es negativo.


A

B

C


Figura 4: A) angulos diedros ,  y  de la cadena principal. B) y C), proyecciones de Newman para mostrar como se miden los ángulos , .

Debes abrir el archivo practico_A.kin con el programa Mage. Algunos pares de valores para  y  generan un alto impedimento estérico lo cual resulta en que algunos pares tienen mayor preferencia que otros. Esto queda expuesto en un Gráfico de Ramachandran (figura 5) donde se representan los pares de ángulos  -  para todos los residuos de aminoácidos de una proteína.




Hoja  paralela

Hoja  antiparelala

Hélice triple del colágeno

Hoja  torsionada a la derecha

 hélice

levógira

 hélice

dextrógira


Figura 5: gráfico de Ramachandran mostrando las regiones favorables en azul oscuro y en celeste. Tomado y traducido de (Nelson & Cox, 2004).

Función de los aminoácidos en la estructura proteica

Los residuos fuertemente hidrofóbicos Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Val, Trp se empaquetan predominantemente unos contra otros para formar el núcleo interior de las proteínas, mientras que los aminoácidos cargados Asp, Glu, Lys, Arg se encuentran casi siempre en el exterior. Los grupos neutros y polares muestran una distribución mas uniforme, con una ligera preferencia hacia el exterior. Los residuos de prolina (Pro) también se ubica por lo general hacia fuera, a pesar de que su cadena lateral no tiene átomos polares, ya que es bueno para inducir la terminación de las hélices  y formación de giros. Gly tiene 3 diferentes tipos de funciones: se encuentra a) en los extremos de las piezas de estructura secundaria (a menudo con valores de ángulos diedros poco comunes), b) en contactos bien compactos en el interior de una proteína, y c) en lugares donde es requerida una cierta flexibilidad en el movimiento.

Muchos aminoácidos juegan roles específicos en algunas posiciones particulares de estructuras secundarias. Gly es por lejos el aminoácido mas común en el extremo C-terminal de las hélices mientras que para el extremo N-terminal son muy comunes Ser, Thr, Asn y Asp, por lo general haciendo un puente-H del oxígeno de la cadena lateral con el grupo NH libre de la cadena principal en el primer giro de la hélice. Curiosamente, Gln es el residuo menos preferido para la posición N-terminal (el grupo metileno extra en su cadena lateral no permite que el oxígeno de la cadena lateral pueda ubicarse en una geometría correcta para formar el puente-H). Esto demuestra que los residuos cuyas propiedades parecen superficialmente similares no siempre juegan un papel equivalente en la estructura de una proteína. Es especialmente común en las posiciones expuestas en el centro de hélices. Pro prefiere las esquinas en la cadena principal, muchas de las cuales están alojadas en un extremo de una pieza de estructura secundaria. Arg y Lys son otro par de residuos similares con roles a menudo divergentes: la parte alifática de su cadena lateral establece contactos hidrofóbicos, mientras que el grupo guanidinio de carga positiva en su extremo es capaz de establecer interacciones electrostáticas y puentes hidrógeno. El grupo guanidinio de la Arg puede establecer hasta 5 puentes hidrógeno con átomos de oxígeno en un plano, y a menudo lo hace, por lo tanto tienden a tener una posición bien definida. Lys, en cambio, forma puentes hidrógeno a través de su grupo NH3, de amplia libertad rotatoria, que suele ser muy móvil en proteínas e interactúa bien con el solvente.

La función principal de los residuos hidrofóbicos grandes es la de formar los núcleos hidrófobos. De las cadenas laterales alifáticas, las que tienen C ramificados (Ile, Val) prefieren ubicarse en láminas , mientras que Leu y Met prefieren hélices .

Motivos estructurales proteicos (practico_B.kin)

Los ejercicios guiados nos permitirán identificar en las diferentes proteínas los tipos de estructura secundaria: hélice , banda  (y su arreglo en hojas) y giros estudiados en la clase teórica. Las estructuras secundarias están mantenidas por puentes hidrógeno entre diferentes residuos de aminoácidos, específicamente entre el grupo N-H de un enlace peptídico y el grupo carbonilo (C=O) de otro enlace peptídico.

hélice: el esqueleto peptídico esta enrollado, como una estructura en espiral, alrededor de un eje imaginario (organización helicoidal de la cadena peptídica). Hay 3,6 aminoácidos en cada vuelta de la hélice. Los grupos N-H de todos los enlaces peptídicos apuntan en la misma dirección, la cual es aproximadamente paralela al eje de la hélice mientras que los grupos C=O de todos los enlaces peptídicos apuntan en la dirección opuesta. El grupo C=O de cada enlace peptídico esta unido por un puente hidrógeno al grupo N-H del enlace peptídico que se encuentra separado de él por cuatro aminoácidos. En la figura 6 se pueden ver dos representaciones esquemáticas de  hélice.




F

Hoja antiparalela

Hoja paralela

igura 6:
estructura esquemática de la  hélice. Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).

Figura 7: tipos de hoja . Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).

Bandas : el esqueleto de la cadena peptídica (hebras o tiras ) se extienden en un arreglo en zigzag similar a una serie de pliegues, con los enlaces peptídicos organizados en planos de inclinación alterna (alternando planos descendentes y planos ascendentes). Cuando dos o más bandas beta interaccionan forman una hoja plegada , que puede formarse entre dos cadenas peptídicas o entre diferentes segmentos de una misma cadena peptídico (figura 7).

En la hoja , los grupos C=O y N-H de los enlaces peptídicos de cadenas adyacentes (o de segmentos adyacentes de una misma cadena) están en el mismo plano apuntando uno hacia el otro, de tal forma que es posible establecer puentes hidrógeno entre ellos. Los puentes de hidrógeno son más o menos perpendiculares al eje principal de la estructura en hoja plegada. Las hojas  pueden ser paralelas (cuando las dos cadenas peptídicas corren en la misma dirección) o antiparalelas (cuando corren en sentido contrario).

Bucles y giros: las estructuras secundarias vistas hasta el momento, hélice alfa u hoja beta, se caracterizan por ser zonas de conformación repetitiva, es decir, se repiten los valores de  y . Sin embargo, además de estas estructuras en las cadenas polipeptídicas podemos encontrar regiones no repetitivas. Muchas de estas zonas no repetitivas son bucles y giros que provocan cambios en la dirección de la cadena polipeptídica que posibilitan que la proteína tenga una estructura compacta. En ocasiones se han denominado a estas zonas regiones no repetitivas de ovillo aleatorio “random coil”). Esta definición no es del todo correcta, puesto que las cadenas polipeptídicas no son flexibles en dichas regiones. Sin embargo, en los extremos N- y C-terminal de las proteínas pueden encontrarse regiones de ovillo aleatorio con gran movilidad conformacional.

Figura 8: representación de un giro  o giro reverso.

Los giros son secuencias cortas, típicamente formadas por tres o cuatro aminoácidos con una conformación característica que impone un brusco giro de 180º a la cadena principal de un polipéptido. Muchos de los cambios de dirección de la cadena polipeptídica se realizan mediante una unidad estructural común conocida como giro beta o giro reverso (beta hairping), ver figura 8. Lo esencial de este giro en horquilla es que el carbonilo de un residuo i forme un puente hidrógeno con el grupo amino del residuo i+3. En consecuencia la cadena puede cambiar bruscamente de dirección. A menudo los giros beta conectan hojas beta antiparalelas. Aminoácidos como Asn, Gly y Pro, que se acomodan mal en estructuras de tipo α o β, aparecen con frecuencia en este tipo de estructura. En una proteína globular los giros β pueden incluir a casi un tercio de los residuos de la proteína.

Además de los giros β existen regiones de conformación no repetitiva de más de cuatro aminoácidos a las que frecuentemente se las denomina loops o bucles (figura 9). Los loops que conectan elementos de estructura secundarias son generalmente cortos (80% son menores de 10 aminoácidos de longitud). Sin embargo, los loops largos (mayor o igual a 10 residuos) suelen conectar dominios diferentes en una misma proteína (figura 9).

Figura 9: presencia de un bucle en una proteína mostrando la alta flexibilidad conformacional que presenta la región (rojo).

La transición T-R en la hemoglobina humana (practico_C.kin)

Para la hemoglobina (Hb), su función como transportadora de oxígeno en la sangre esta fundamentalmente vinculada al equilibrio entre los dos estados principales de su estructura cuaternaria, conocidos como "estado T", no ligado o "desoxi" y "estado R" ligado a "oxígeno" u oxi. En estos ejercicios guiados estudiaremos los cambios estructurales que ocurren durante esta transición y su importancia en las propiedades funcionales, tales como el proceso cooperativo de unión al oxígeno y la regulación alostérica por el pH y los aniones. La Hb no es un sistema puro de dos estados, pero la transición de T a R proporciona la explicación más importante, de primer nivel de su función.

Para estudiar la transición se llevará a cabo una comparación entre las estructuras cristalinas de la desoxi-hemoglobina humana, que está en el estado T sin ligandos en el sitio de unión de O2, y la carbomonoxi-hemoglobina humana, que se encuentra en el estado-R y contiene ligandos en los 4 sitios. Estas estructuras de Hb fueron las primeras resueltas con una resolución bastante alta y se estudiaron detalladamente (Baldwin & Chothia, 1979). Pueden encontrarse en el Protein Data Bank (PDB) bajo los códigos de acceso 3HHB y 1HCO.

La molécula de Hb es un tetrámero de dos cadenas α y dos cadenas β. En humanos contienen 141 y 146 residuos, respectivamente. Sus secuencias son diferentes, pero homólogas, y comparten una estructura terciaria tipo todo hélice. Cada subunidad está formada por 6 hélices principales y 2 hélices cortas que conforman el tipo de plegado conocido como “globina”. Las hélices se denominan secuencialmente de la A a la H, que es el esquema de nombres tradicionales. Por ejemplo, la histidina proximal (el residuo encargado de unir el Fe del grupo hemo a la proteína) a menudo se llama His F9, ya que es el residuo 9 de la hélice F. (En la cadena  humana se corresponde con el residuo 87). Las hélices forman un manojo aproximadamente cilíndrico, con el grupo hemo y su átomo de Fe central ligado en un bolsillo hidrofóbico entre las hélices E y F.

Ambas cadenas α y β de la Hb se asemejan a la mioglobina (la proteína fijadora de O2 de cadena única presente en el músculo), tanto en la estructura terciaria en general como en el uso de un átomo de Fe en el centro de un grupo hemo como el sitio donde el oxígeno se une reversiblemente. El hemo está rodeado de un bolsillo hidrofóbico, lo cual es necesario a fin de que el oxígeno se una de forma reversible sin producir oxidación de la proteína junto a otras reacciones indeseables. De hecho, los residuos hidrofóbicos rodean el sitio de unión tan estrechamente que para que el O2 pueda entrar o salir del mismo, es necesario que distintas partes de la proteína se pongan en movimiento para permitir el paso de la molécula de gas. En consecuencia las propiedades dinámicas son esenciales para que sea posible la unión a O2 y este proceso restrictivo también aumenta la especificidad de la unión del ligando.

Los grupos hemos responsables de la unión al oxígeno se encuentran muy distantes unos de otros en la proteína, de modo que las interacciones entre ellos deben estar mediados por cambios en la estructura proteica. El estado no ligado (desoxi) se llama "T" (de "tensa"), ya que contiene interacciones estabilizantes extras entre las subunidades. En la conformación de alta afinidad del estado-R (de “relajado”) las interacciones que se oponen a la unión del oxígeno y estabilizan el tetrámero son algo más débiles. En algunos organismos esta diferencia es tan pronunciada que sus moléculas se disocian en dímeros de Hb en forma oxigenada. La Hb humana ligada también se disocia cuando se diluye, lo que plantea problemas en el uso de sustitutos de la sangre libre de células basadas en Hb porque la proteína disociada se excreta rápidamente.

El cambio entre los estados R y T requiere la interacción de subunidades y no se produce en la mioglobina, o en monómeros de cadena α o β aislados. Estos monómeros unen O2 muy bien, lo cual sería útil para cargar O2 en los pulmones, pero no permitiría la liberación para su entrega a los tejidos. Por lo tanto, la característica central crítica de la función de la hemoglobina es cómo logra, usa y controla alostéricamente la cooperatividad entre los 4 sitios de unión en el tetrámero para ajustar la unión de O2 para satisfacer las necesidades fisiológicas. Las interacciones entre las subunidades  y  son críticas para la cooperatividad en la unión del oxígeno. En una primera aproximación, la molécula de hemoglobina se compone de dos "dímeros" (α1-β1 y α2 -β2) que giran uno en relación al otro como cuerpos rígidos en la transición R-T. Al comparar la estructura de ambas moléculas notaremos que el dímero α1-β1 sufre un reordenamiento interno relativamente pequeño, pero su rotación total es considerable. La rotación neta de los dos dímeros altera las interacciones entre sí, sobre todo en el sitio efector alostérico entre β1 y β2 y en la interfase entre α1-β2 donde las mutaciones tienen el mayor efecto sobre las propiedades alostéricas de la Hb.

La relación del sitio de unión a los cambios en la conformación de proteínas esta mediada por la unión del Fe en el grupo hemo a la His proximal en la Helice F. La unión del O2 al Fe resulta en cambios de estructura terciaria que pueden entonces transmitir sus efectos a otras subunidades en el conjunto tetramérico (figura 9). Esto permite al O2 unirse en una subunidad y afectar indirectamente la afinidad de otras subunidades. Los cambios en la interfaz de la subunidad (junto con los cambios en el Fe) alteran el equilibrio entre las estructuras cuaternarias desoxi y oxi al tiempo que un cambio de estructura cuaternaria altera la afinidad por ligando dentro de una subunidad dada. Cada O2 que se une aumenta la probabilidad de llevar el tetrámero al estado oxi, y una vez que sucede este cambio, la afinidad por el O2 en todos los sitios aumenta porque los cambios de estructura local ya han ocurrido o son más fáciles de llevar a cabo.

En la interfaz entre α1 y β2, las subunidades se desplazan una contra la otra entre el estado-T desoxi y el estado-R oxi. A pesar que la simetría no es exacta, hay partes similares de las subunidades que contactan entre sí: la hélice C, y el "codo FG" entre las hélices F y G. Dado que la transición es un movimiento complejo orquestado entre el encaje de dos conjuntos de contactos muy diferentes en los dos estados, esta interfaz es fundamental para hacer funcionar el alosterismo en la Hb. Se demostró que las mutaciones de los residuos en esta interfaz tienen especial influencia sobre la cooperatividad y el alosterismo.

Los puentes salinos que se establecen en las interfases entre las distintas subunidades juegan un rol importante en la dependencia del pH de la unión de oxígeno, lo cual es conocido como el Efecto Bohr. Los puentes salinos entre α1 y α2 y en el extremo C-terminal de β2 estabilizan el estado-T desoxi. La His 146 se titula a un pH muy cercano al fisiológico, por lo cual las interacciones establecidas por este residuo son muy sensibles al pH. A pH bajo, cuando más protones están presentes, es más probable encontrar protonado al N del anillo de His dándole una carga positiva, reforzando la interacción con Asp 94. Esto favorece el estado T, disminuyendo la afinidad por el O2.

Hay también una contribución al Efecto Bohr debido a las cadenas laterales cargadas en la cavidad central del tetrámero, donde por ejemplo la unión del anión que favorece el estado T es pH dependiente. El efecto del pH o efecto Bohr, puede ser considerado como una regulación alostérica por la unión de protones. Es importante biológicamente, porque promueve la descarga de oxígeno en los tejidos donde las concentraciones de protones son elevados debido, por ejemplo, a la producción de ácido láctico en el músculo.

La desoxi Hb presenta sitios de unión a fosfato en la cavidad central del tetrámero, los cuales están ausentes en la oxi Hb. En la oxi Hb, las subunidades  se acercan entre si, expulsando los grupos fosfatos del 2,3-bisfosfoglicérato (2,3 BPG), y permitiendo que los extremos N-y C-terminal interactúen. El 2,3 BPG y otros fosfatos se unen mucho más fuertemente a la estructura cuaternaria desoxi, por lo que necesariamente desplazan el equilibrio hacia desoxi Hb, y debido a esto disminuyen la afinidad por O2. Estas moléculas de fosfato de regulación son útiles en la sangre, debido a que sus concentraciones se pueden controlar para cambiar la curva de afinidad de la Hb por el O2 a fin de que se trabaje en la parte más pronunciada y eficiente en las condiciones imperantes en los pulmones y los tejidos.



Figura 9: Alosterismo en la hemoglobina. El ligando, en este caso el O2 facilita la unión de más moléculas de ligando, estabilizando alostéricamente la estructura relajada de mayor afinidad por el mismo. El O2 se une a la primera subunidad e induce un cambio en la conformación que se transmite a las otras subunidades de la proteína. Imagen tomada de (Martinez, Jorge, 2012).

Bibliografia:

Baldwin, J., & Chothia, C. (1979). Haemoglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric mechanism. Journal of Molecular Biology, 129(2), 175–220.

Koolman, J., & Rhm, K. H. (2004). Color Atlas of Biochemistry (2 Rev Enl.). Thieme.

Martinez, Jorge. (2012). el moderno prometeo: Proteínas alostéricas. Recuperado abril 17, 2012, a partir de http://elmodernoprometeo.blogspot.com.ar/2011/10/proteinas-alostericas.html

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition (4th ed.). W. H. Freeman.

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