1 que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda manipular fácilmente, o sea hablar de mg y g de proteínas purificadas para hacer estudios con esa proteína, y 2




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título1 que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda manipular fácilmente, o sea hablar de mg y g de proteínas purificadas para hacer estudios con esa proteína, y 2
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Clase 7

Purificación de proteínas

Veamos entonces purificación de proteínas. Hay técnicas Cromatográficas, Técnicas Electroforéticas, Técnicas de diálisis, Técnicas de precipitación (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de Purificación, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Específica. Y de eso vamos a hablar ahora.
¿Para qué les puede servir a ustedes la purificación de proteínas, si un médico va a comprar todo en polvo, en una caja…no tiene que purificar nada? Ésta es mi opinión: para leer papers. Porque cuando lean un artículo científico y estén trabajando con una proteína (sobretodo si es una proteína nueva), va a aparecer en metodologías cómo se purificó esa proteína, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para seguir esa metodología y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la literatura científica de proteínas que son emergentes o de algún artículo clásico en el cual se indique cómo se purificó el ¿?. Y ¿para qué también les sirve? Es un pretexto para poner en práctica todo lo que hemos aprendido desde acá hacia atrás.
Veamos la separación de proteínas. A ver, aquí hay dos elementos que son importantes cuando uno separa una proteína, ¿y de qué la estamos separando? Imagínense, tenemos una célula, las células tienen miles de proteínas, y miles de tipos de moléculas, que no son proteínas, no todas son proteínas. Lo que nosotros nos proponemos es aislar UNA proteína, una sola (y probablemente esté en muy baja concentración) para hacer estudios de funcionalidad y saber esa proteína en qué tipo de proceso biológico está. Aislar esa proteína tiene un desafío doble: 1) que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda manipular fácilmente, o sea hablar de mg. y g. de proteínas purificadas para hacer estudios con esa proteína, y 2) ojalá que esa proteína que yo aíslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el polvo, por ejemplo), esa proteína, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no tenga contaminantes. No me sirve una proteína que esté muy contaminada para un estudio de funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo último que dije) y de rendimiento (que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cuánto estoy obteniendo, y la pureza tiene que ver con qué estoy obteniendo. Entonces todas las técnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un compromiso entre Rendimiento y Pureza, ¿de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o sea para obtener gramos de una proteína, necesito sacrificar la pureza de la proteína. Y otras veces para obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a través líneas sucesivas de purificación, que hacen que yo vaya perdiendo proteína en el camino, pero me estoy asegurando que esa proteína va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se contraponen y por lo tanto la purificación de la proteína supone un compromiso entre purificación y rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas técnicas, y muchas de estas técnicas se utilizan una a continuación de la otra, de tal manera que me asegure que el producto está puro. Pero probablemente hay un orden obligado de algunas técnicas y por ejemplo una de las técnicas que primero se aplica en un compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una proteína es la Precipitación Salina y les voy a explicar por qué.
Precipitación Salina
¿Qué es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una proteína? Vamos a poner un ejemplo verídico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, así que les diré que purifiqué una vez la proteína de la alcayota, sí, la alcayota, y es una enzima proteolítica, es decir, capaz de romper proteínas, es decir, hidroliza el enlace peptídico. Entonces, ¿qué debía hacer yo para purificar la enzima de la alcayota? (la enzima proteolítica). Es una enzima ¿ya?, la mayoría de las enzimas son proteínas. Recientemente se está hablando que hay RNA que tienen actividad enzimática, por eso hago el alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son proteínas. Entonces, había una enzima que rompía proteína (que era la enzima proteolítica de la alcayota), y había que purificarla. ¿Qué harían? Romper la alcayota ¿cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aquí tenemos que tomar una decisión. Primero, ¿la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningún problema en sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la célula para que la enzima salga, así que ya tenemos un primer problema. Tendría yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera que me asegure que están todos los citoplasmas expuestos digamos y la proteína por tanto la puedo obtener en el exudado de la alcayota. Así que, de acuerdo, ésta es extracelular y es fácil, sacamos el juguito a la alcayota. ¿Qué hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina’ no más…¿qué hago? Filtro. Colamos, filtramos. Y después tengo un jugo que yo supongo que es relativamente “puro”. Una de las primera técnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar sal, para variar la solubilidad de las proteínas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la proteína B en este gráfico:

Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una proteína:

- Solubilización por salado.

- Precipitación por salado.


Y esto es solubilidad versus concentración de sal. Primero aumenta la solubilidad y después disminuye la solubilidad. ¿Por qué? ¿De qué modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, ¿qué significa que sean poco soluble? ¿cómo están entre sí? ¿se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si son hidrofóbicas están juntas porque los demás las rechazan ¿cierto? Si son hidrofílicas están juntas porque tienen afinidad mutua, y por lo tanto no interactúan tanto con el agua. Si fuese así, diríamos que tienen poca solubilidad. [pregunta ké es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto. Y hasta aquí no más disuelve la proteína del agua, hasta aquí no más con esa concentración de sal, esta concentración de sal es la máxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay entre moléculas de las proteínas que hacen que se vayan al fondo y no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas, de tal manera que las cargas de la proteína interactúen más bien con la sal que con la misma proteína, y como la sal es soluble, todo feliz. El problema es cuando agrego más sal, porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteína B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilización por saldo [cuando la curva sube] y a éste [cuando la curva baja], salting-out = precipitación por salado) agrego más sal, ¿por qué empiezan a precipitar las proteínas? [un niño responde algo de que le kitan el lugar…disminuyen las interacciones con las proteínas]. Exacto, entonces las proteínas se sienten rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicífico para una proteína, la proteína B, la proteína A y C van a responder de manera distinta, y ESE es el secreto para purificar. Porque significa que si yo agrego una oncentración de sal determinada va a haber proteínas más solubles que otras. Por ejemplo a ésta concentración, la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la A. [Señala en el gráfico, cuando la curva C está arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo centrifugo este compuesto a esa concentración de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C, y así me quedo con la proteína C. Uds. dirán: “pero si esto no precipita completamente”, bueno obvio ¬¬, si es la primera etapa de purificación, pero indudablemente enriquecí la proteína C. Y lo mismo pasa si agrego poquita sal, voy a tener más soluble la A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteínas y eso es empleado como una etapa primera de purificación de proteínas. Ojalá no la denature, porque si la denatura, sonamos con la purificación…es difícil renaturar las proteínas. No se dice “redenaturar”, se dice “Renaturar”
¿Cómo puedo ver una proteína que es microscópica? ¿Cómo puedo saber que la proteína está presente? Viendo la funcionalidad de la proteína.
¿Qué es la solubilidad? (una vez más) cantidad máxima de soluto que se puede disolver en un solvente determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , así que hasta aquí no mas disuelve la proteína del agua , hasta aquí no mas con esta concentración de sal, hasta aquí no mas esta concentración de sal es la máxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las moléculas de la proteína, que hace que se vayan al fondo y no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas, de tal manera que las cargas de las proteínas interactúen mas bien con la sal que con la misma proteína, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y precipitación por salado)

Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, ¿porque empiezan a precipitar estas proteínas? Porque ahí la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las proteinas lo hagan, y por lo tanto a las proteínas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una concentración de sal determinada, va a haber proteinas más solubles que otras. Por ejemplo a esta concentración X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo centrifugo ese compuesto a esa concentración de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificación, pero indudablemente enriquecí la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podría pasar si agrego poquita sal, voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso fue empleado como una etapa primaria de purificación Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede purificar, porque es difícil renaturar.


Entonces la solubilidad aumenta porque al agregar sal, el primer efecto al haber pocas concentraciones de sal, es disminuir las interacciones entre las proteínas, porque la sal compite. La sal esta disuelta asi que todo bien para que las proteínas tambien esten disueltas, no se van al fondo.

Pregunta: ¿como saber hasta que punto agregar sal, si se poco de la proteina? Ensayo y error, y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la proteina que te interesa.

¿Como veo una proteína que es microscópica? Viendo la funcionalidad de la proteina, por ejemplo si tengo una proteína que es inflamatoria, para saber si la tengo los extractos de la proteína se los inyecto en la pata de una rata, y veo si se inflama o no midiendo el diámetro de la pata. Eso se llama ensayo biológico, tenemos ensayos quimico, bioquimicos y biológicos del extracto que estas obteneniendo y saber si la tienes en mayor o menor concentración, y al mismo tiempo mides proteína total, para saber con cuanta proteína te estas quedando. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la proteina, asi que, es necesario poder observar la proteina de alguna manera, sino no se si la tengo o no la tengo.

Hay otro método de purificación: La diálisis. Imagínense que precipite la enzima proteolitica de la alcayota, y lo que obtuve, me quede con el precipitado, no con el soluble. Y la redisuelvo, y va a estar contaminada con sal, porque el método anterior que utilice fue precipitación salina, entonces lo que esta rojo seria la sal, y lo que esta en verde seria la proteína. Y si pongo una membrana de celofán o semipermeable, con un diámetro de poro que permita que salgan los iones de sal, pero no permita que salgan la proteína, entonces a través de difusión simple yo veo que sal empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a fuera que es pura agua, y voy a quedar con la proteína mucho mas pura, voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a través de la diálisis.

Ahora piensen que tal vez esa proteína tenía una molécula que siempre la acompaña y que la inhibía o bajaba su actividad, probablemente esa molécula en ese paso salga y la pierda. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy introduciendo modificaciones en la muestra, y probablemente haya algún factor que sea importante para la actividad de la enzima, y que a lo mejor encendía o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si era de bajo peso molecular, así que puede que suceda y puede que no. Si son moléculas de alto peso molecular, se aplican otras técnicas más gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.

Cuando uno trabaja con una proteína que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar de interpretarlos.

Esa era una segunda etapa de purificación, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo acá, y los ocupo en técnicas que voy mostrando a continuación.
Hay un tipo de cromatografía que es la de partición, es cuando a través de la solubilidad se separa un soluto que se distribuye en forma diferente en fase sólida como un papel, a una fase móvil que puede ser una muestra de distintos solventes, agua con etanol, con butanol, distintos alcoholes para dar la polaridad apropiada. Consistía en una cámara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad determinada, y ponían un fase sólida que podía ser un papel, que es pura celulosa (que a su vez esta formada por glucosa), la celulosa tiene enlaces glucosidicos, B 1-4 para establecer las cargas, son puros polimeros de enlaces B 1-4. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero, que ese constituye el papel en este caso. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua, por lo tanto esta hidratada.

Cuando agregamos una muestra, esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente, y el solvente sube por capilaridad. ¿Por qué sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad, la glucosa tiene polaridad, por lo tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir, porque tiene afinidad, hay fuerzas que la une a la glucosa, y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa, tiende a subir el liquido porque se están encaramando las moléculas del solvente sobre la celulosa, entonces sube el solvente (no solo es agua, puede ser con componentes mas apolar, como ser alcohol) a través del papel y el soluto que estaba en la línea de partida con línea segmentada, va a seguir el frente del solvente como pueda, porque ama al solvente, al agua que hidrata a la celulosa, y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria). Entonces si tengo un aminoácido muy polar, va a tener atracción por la fase estacionaria que es glucosa y agua, y si la fase movil, que es agua y una componente hidrofobica, va a tener menor afinidad por el aminoácido. Entonces este aminoácido no sigue al frente, se va retrasando. ¿Por qué se retrasa? La molécula comparte su tiempo entre la fase movil y la estacionaria, se sienta a descansar o avanza con el solvente, eso es al azar, pero pasa más tiempo con quien tiene más afinidad.


Si tengo distintas moléculas, que tienen distinta afinidad relativa entre fase movil y estacionaria, no van migrar de la misma forma, algunas llegaran más lejos y otras se quedaran mas cerca de la línea de partida. Ahí aparece Rf: que es un coeficiente dado entre lo que migro el soluto, y lo que migro la fase estacionaria. Ustedes calculan ese Rf y lo pueden utilizar en casos para propositos de comparación.
Entonces aquí agregamos una muestra, una gota que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminoácidos distintos que estoy separando. Entonces los identifico, porque después los rocío con un colorante para aminoácidos ( hay uno que interactúa con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y ese colorante cuando se rocía sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho que era por ejemplo aspartico, glutámico y fenilalanina, y pondré en paralelo los mismos pero comprados y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el que pienso es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.



Pero estas técnicas ya no se usan, pero sirven para procesar y aplicar lo que sabe, actualmente se usan identificadores para aminoácidos, técnicas de cromatografía de alta presión, pero son técnicas caras.
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